Бактерии-деструкторы дибутилфталата, выделенные из ризосферы мятлика лугового (Poa pratensis L.)

В настоящее время вследствие интенсивного производства и применения синтетических полимеров наблюдается широкое распространение эфиров фталевой кислоты (фталатов) в объектах окружающей среды. Наиболее широко используется в различных областях промышленности один из эфиров фталевой кислоты – дибутилфталат (ДБФ). Он обладает высокой растворяющей способностью и низкой вязкостью, что обусловливает его применение для изменения свойств полимеров с целью повышения их эластичности, морозостойкости. ДБФ применяется в резинотехническом производстве, при изготовлении искусственных пленок, кабельных пластикатов, эфира целлюлозы, линолеумов, лаков и искусственных смол. Фталаты и их метаболиты признаны потенциально опасными для человека и животных, т.к. обладают гепатотоксичными, тератогенными и канцерогенными свойствами [Liang et. al., 2008].

Наличие значительного количества фталатов (в том числе ДБФ) выявлено в районах интенсивной работы предприятий горнодобывающей промышленности. Так, данные соединения обнаружены в глинисто-солевых шламах, избыточных рассолах и отходах калийного производства вследствие использования в технологическом цикле обогащения калийных руд реагентов (оксиэтилированных жирных кислот, нефтепродуктов, диоксановых спиртов и др.), продуктами трансформации которых являются фталаты [Бачурин, Одинцова, 2006].

Известно, что период полураспада ДБФ в окружающей среде составляет от нескольких месяцев до 20 лет, и основную роль в процессе разложения этого соединения выполняют бактерии-деструкторы [Liang et. al., 2008]. Среди штаммов, осуществляющих аэробную деструкцию ДБФ, обнаружены бактерии различных филумов, наиболее часто встречаются представители родов Arthrobacter , Bacillus , Burkholderia , Gordonia , Pseudomonas , Rhodococcus [Liang et al., 2008; Jin et al., 2010; Stanislauskiene et al., 2011; Ka-naujiya, Sivashanmugam, Pakshirajan, 2022]. Метаболические пути разложения эфиров фталевой кислоты аэробными бактериями сочетают два процесса – первичную деградацию диэфиров фталата до моноэфиров и последующую их деструкцию до орто -фталевой кислоты (ФК), являющейся центральным метаболитом деструкции большинства фталевых эфиров. Дальнейшее разложение ФК осуществляется через образование протокатеховой кислоты (в качестве ключевого метаболита) до основных продуктов жизнедеятельности микробной клетки [Eaton, 2001; Liang et al., 2008; Vamsee-Krishna, Phale, 2008; Kasai et al,, 2019].

Фиторемедиация становится все более популярной и востребованной технологией восстановления загрязненных почв, поскольку является высокоэффективным, надежным, малозатратным и экологически чистым методом. При этом для эффективной очистки почв предполагается использование устойчивых растительно-микробных ассоциаций, содержащих в ризосфере бактерии, способные осуществлять деструкцию органических поллютантов, присутствующих в почве [Wenzel, 2009; Randika et al., 2022]. В ряде исследований показано положительное влияние высадки растений на очистку почвы от фталатов [Li et al., 2014; Liao, Nishikawa, Shih, 2019; Wu et al., 2019]. Однако исследования микроорганизмов ризосферы растений, выращенных на загрязненной фталатами почве, на сегодняшний день крайне немногочисленны [Zhang et al., 2015; Wu et al., 2019].

Цель работы – характеристика бактерий-деструкторов дибутилфталата, выделенных из ризосферы растений мятлика лугового, произрастающих в районе промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей (Пермский край).

Материалы и методы

Объекты исследования . Из рабочей коллекции микроорганизмов Лаборатории микробиологии техногенных экосистем Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН для исследования были отобраны 76 штаммов, выделенных из ризосферы растений, произрастающих на территории Верхнекамского промышленного региона (Пермский край).

Также в работе использованы два штамма NKDBFbel и NKDBFgelt, полученные из накопительной культуры при инкубировании на ДБФ в качестве субстрата. Штаммы были выделены из образца ризосферы мятлика лугового ( Poa pratensis L.), отобранного вблизи солеотвала (г. Соликамск, Пермский край, Россия).

Среды и условия культивирования . Для культивирования бактерий использовали минеральную среду Раймонда (МСР) следующего состава (г/л): NH 4 NO 3 – 2.0, MgSO 4 х 7H 2 O – 0.2, K 2 HPO 4 – 2.0, Na 2 HPO 4 - 3.0, CaCl 2 x 6H 2 O - 0.01, Na 2 CO₃ - 0.1, дополненную 1%-ным раствором MnSO 4 x 2H 2 O -2 мл/л и 1%-ным раствором FeSO 4 x 7H 2 O - 1 мл/л среды [Raymond, 1961]. В качестве субстратов использовали ФК и ДБФ в концентрации 1.0 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (БСР) в МСР добавляли 5 г/л триптона («VWR Life Science Amresco», США) и 2.5 г/л дрожжевого экстракта («Bi-ospringer», Франция) в качестве ростовых субстратов. Для приготовления плотных сред вносили агар («Helicon», Россия) до конечной концентрации 15 г/л.

Морфологические характеристики бактерий определяли при выращивании на агаризованной БСР. Культивирование осуществляли при температуре 28°С. Описание морфологии колоний проводили на седьмой день культивирования. Для микроскопирования клеток использовали 48-часовые культуры бактерий [Методы ..., 1983].

Секвенирование и анализ генов 16S рРНК. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с применением набора реактивов «GenSeq-100» («Синтол», Россия) на автоматическом секвенаторе Нанофор 05 («Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителя. Анализ полученных последовательностей осуществляли с использованием программ Sequence Scanner v. 2.0, MEGA v. 11.0 . Поиск гомологов генов 16S рРНК осуществляли по международным базам данных GenBank (http:/ и EzBioCloud .

Рост бактерий на ФК и ДБФ оценивали при культивировании в жидкой МСР. Субстрат вносили до конечной концентрации 1.0 г/л. Инокулятом служила культура, выращенная на агаризованной БСР при 28°С. Биомассу бактерий ресуспендировали в МСР, полученную суспензию бактериальных клеток (ОП 600 =1.0) добавляли в 100 мл среды в количестве 1% об./об. Культивирование штаммов бактерий осуществляли в колбах объемом 250 мл (объем среды – 100 мл) на термостатируемом шейкере Environmental Shaker Incubator ES-20/60 («BioSan», Латвия) при температуре 28°С и скорости вращения 140 об/мин. Оптическую плотность (ОП) культуральной жидкости определяли на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Расчет удельной скорости роста ( μ , ч^-1) проводили по стандартной формуле

μ = (lnB2 – lnB1) / (t2 – t1), где В1 и В2 – оптические плотности культуры в моменты времени t1 и t2 соответственно [Нетрусов, 2005].

Оценку разложения ДБФ бактериями осуществляли методом газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС). Штаммы выращивали в среде МСР, содержащей дибутилфталат (1.0 г/л), клетки собирали центрифугированием (9 000 об/мин, 5 мин.) и отмывали при помощи МСР. Отмытые дважды клетки (ОП 600 =2.0) инокулировали в 1 мл МСР с ДБФ (0.2 г/л) и инкубировали при 28°С в течение трех суток при аэрации на роторном шейкере (150 об/мин). Экстракцию ДБФ осуществляли равным объемом гексана в течение 120 мин. на шейкере при 100 об/мин. Остаточную воду удаляли из образцов путем введения безводного сульфата натрия. Анализ проводили на газовом хроматографе-масс-спектрометре «Agilent» 7890B модель G3440B («Agilent», США), с кварцевой колонкой RESTEK RTx-5MS («Restek», США). Анализ хроматограмм проводили с использованием программы MassHunter Qualitative Analysis 10.0 («Agilent», США.). Идентификацию ДБФ проводили путем сравнения времени выхода пиков со временем выхода пиков контрольного соединения, а также по хромато-масс спектрам.

Расчет удельной скорости утилизации ( μ , сут^-1) проводили по стандартной формуле

μ = (lnС1 – lnC2) / (t2 – t1), где С1, С2 – концентрация субстрата в начальный и конечный моменты времени t1 и t2 соответственно [Нетрусов, 2005].

Статистическая обработка результатов . Все эксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel 2007.

Результаты и их обсуждение

В ходе проведенной работы 76 штаммов, выделенные из образцов ризосферы растений с территории солеразработок (г. Березники, г. Соликамск, Пермский край), были исследованы на способность к росту на ДБФ и ФК – ключевом метаболите бактериального разложения ДБФ. В результате из 14 активных деструкторов ФК только один штамм (Rh7bel), изолированный из ризосферы мятлика лугового (Poa pratensis L.), был способен к росту на дибутилфталате как единственном источнике углерода и энергии. При культивировании на агаризованной БСР штамм Rh7bel формировал округлые непрозрачные колонии диаметром 1.5–2.5 мм с ровным краем, гладкой матовой поверхностью, выпуклым профилем, мелкозернистой структурой и мягкой консистенцией. Клетки штамма грамположительные, неподвижные, в стационарной фазе роста представлены длинными палочками. На основе анализа фрагмента гена 16S рРНК (808 п.н.) было установлено, что штамм Rh7bel проявлял сходство на уровне 100% с Rhodococcus wratislaviensis NBRC 100605T.

Штаммы-деструкторы дибутилфталата NKDBFbel и NKDBFgelt имели округлые полупрозрачные колонии диаметром 2–4 мм с ровным краем, гладкой блестящей поверхностью, выпуклым профилем, однородной структурой и мягкой консистенцией. Штамм NKDBFbel на агаризованной БСР формировал колонии белого цвета, а штамм NKDBFgelt – желтого цвета. Клетки обоих штаммов грамположительные, неподвижные, в стационарной фазе представлены утолщенными короткими палочками. На основе анализа фрагмента гена 16S рРНК штаммы NKDBFbel и NKDBFgelt по гену 16S рРНК (594 и 602 п.н., соответственно) имели сходство на уровне 99.83% с двумя типовыми штаммами – Pseudarthrobacter oxydans DSM 20119^T и Pseudarthrobacter polychromogenes DSM 20136^T.

Исследованы ростовые характеристики штаммов Rh7bel, NKDBFbel и NKDBFgelt при росте на ДБФ и ФК в качестве субстратов (рис. 1, 2; таблица). Штаммы имели высокие показатели максимальной ОП при росте на ФК (>1.0), но только у штамма NKDBFgelt были зарегистрированы сравнимые значения ОП при росте на ДБФ (таблица). Максимальные значения удельной скорости роста культуры выявлены у штамма NKDBFgelt при росте на обоих субстратах. Штамм Rhodococcus sp. Rh7bel демонстрировал высокие показатели при росте на ФК, однако в процессе инкубирования на ДБФ клетки штамма формировали конгломераты, что могло повлиять на регистрацию низких значений параметров роста культуры (рис. 1, 2; таблица).

О 24 48 54 72 78 96 102 168 174

Параметры роста штаммов Rh7bel, NKDBFbel, NKDBFgelt на ДБФ и утилизации ДБФ [Growth parameters of strains Rh7bel, NKDBFbel, NKDBFgelt and DBP utilization]

Параметры роста	Rhodococcus sp. Rh7bel		Pseudarthrobacter sp. NKDBFbel		Pseudarthrobacter sp. NKDBFgelt
Ростовой субстрат, 1.0 г/л	ФК	ДБФ	ФК	ДБФ	ФК	ДБФ
Удельная скорость роста, ч-1	0.041± 0.003	0.002± 0.001	0.008± 0.001	0.003± 0.001	0.054± 0.003	0.016± 0.002
Максимальное значение ОП 600	1.10	0.27	1.04	0.46	1.25	1.11
Лаг-фаза роста, ч	24	78	78	24	54	24
Удельная скорость утилизации, ч-1	н.о.	0.018± 0.002	н.о.	0.008± 0.002	н.о.	0.009± 0.003
Утилизация, %	н.о.	70.7±0.4	н.о.	43.3±0.3	н.о.	45.1±0.3

Примечание: н.о. – не определяли.

Время, ч

-♦■Rh7bcl 1 NKDBFbel *NKDBFgelt         ♦Rh7bel 4 NKDBFbel *NKDBFgelt

Л                                                              /;

Рис. 1. Рост штаммов-деструкторов на ФК ( A ) и ДБФ ( B ) (1.0 г/л) в МСР

[Growth of destructor strains on FA ( A ) and DBP ( B ) (1.0 g/L) in MMR]

С использованием метода ГЖХ-МС исследована способность штаммов к утилизации ДБФ (рис. 2). Наиболее высокие показатели утилизации субстрата (70.7% за 72 ч.) и максимальная удельная скорость потребления дибутилфталата (0.018±0.002 ч^-1) зафиксированы у штамма Rhodococcus sp. Rh7bel. Два других штамма-деструктора рода Pseudarthrobacter показали снижение количества ДБФ лишь на 43–45% за 72 ч. эксперимента.

Рис. 2. Утилизация ДБФ (0.2 г/л) исследуемыми штаммами

[Utilization of DBP (0.2 g/L) by the studied strains]

На основании известных путей деструкции эфиров фталевых кислот бактериями рода Rhodococcus и Pseudarthrobacter можно предположить, что разложение дибутилфталата исследуемыми штаммами осуществляется до монобутилфталата, затем до образования ключевых метаболитов – фталевой кислоты и протокатеховой кислоты, которые далее метаболизируются в цикле трикарбоновых кислот [Choi et al., 2005; Jin et al., 2010; Chen et al., 2021].

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что штаммы-деструкторы Rhodococcus sp. Rh7bel, Pseudarthrobacter sp. NKDBFbel и NKDBFgelt, выделенные из ризосферы растений мятлика лугового ( Poa pratensis L.), произрастающих на почвах, загрязненных отходами калийного производства, способны к эффективному росту на среде с дибутилфталатом в качестве субстрата. Активность штаммов-деструкторов ДБФ подтверждена ростом на ключевом метаболите разложения ДБФ – орто фталевой кислоте, и эффективной утилизацией этого метаболита. Штамм Rhodococcus sp. Rh7bel имел наиболее высокое значение утилизации ДБФ (70.7% за 72 ч., при начальной концентрации субстрата 0.2 г/л) и максимальную удельную скорость потребления ДБФ (0.018±0.002 ч^-1). Таким образом, ризосферные штаммы-деструкторы ДБФ Rhodococcus sp. Rh7bel, Pseudarthrobacter sp. NKDBFbel и NKDBFgelt являются перспективными для дальнейшего изучения и разработки технологии фиторемедиации почв, загрязненных фталатами.