Бактерии-деструкторы орто-фталевой кислоты, выделенные из отходов калийного производства

Фталаты представляют собой производные фталевой кислоты, которая существует в виде трех изомерных форм: орто-изомер (фталевая кислота), мета-изомер (изофталевая кислота) и пара-изомер (терефталевая кислота), структурно различающиеся радикалами R, R’ сложноэфирной группы (рис. 1). Фталаты широко используются в качестве пластификаторов, при синтезе полиэфирных волокон и полиэтилена. Выявлены гепатотоксичные, тератогенные и канцерогенные свойства этих соединений (Liang et al., 2008). Фталаты отнесены к группе суперэкотоксикантов (стойким органическим загрязнителям, СОЗ), к которым в настоящее время предъявляются наиболее жесткие экологические требования (Стокгольмская конвенция. .

Фталаты обнаружены в отходах горнодобывающей промышленности, в том числе в глинистосолевых шламах, избыточных рассолах отходов калийного производства (разработки Верхнекамского месторождения солей, Пермский край). Учитывая полное отсутствие этих соединений в породах галогенных формаций, высокий уровень загрязнения отходов данного производства обусловлен использованием в технологическом цикле обогащения калийных руд целой гаммы реагентов (оксиэтилированные жирные кислоты, нефтепродукты, диоксановые спирты и др.), продуктами трансформации которых и являются фталаты (Бачурин, Одинцова, 2006).

Известны бактерии, способные осуществлять разложение фталатов. Среди таких организмов вы- явлены представители родов Sphingomonas, Com-amonas, Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Gordonia, Bacillus, Delftia, Acinetobacter (Liang et al., 2008). На рис. 1 представлены метаболические пути разложения эфиров фталевой кислоты, сочетающие два процесса: первичная биодеградация диэфиров фталата до моноэфиров и последующая их деструкция до орто-фталевой кислоты. Разложение ортофталевой кислоты аэробными бактериями осуществляется через образование протокатеховой кислоты (ПКК), в качестве основного метаболита, до основных продуктов жизнедеятельности микробной клетки (Vamsee-Krishna et al., 2006).

Цель работы – исследование разнообразия бактерий-деструкторов орто -фталевой кислоты, выделенных из глинисто-солевых шламов района солеразработок.

Материалы и методы исследования

Образцы техногенно-минеральных образований (ТМО) были отобраны из шламохранилища предприятия БКРУ1 ОАО «Уралкалий» (г. Березники). В составе исследуемых образцов обнаружены органические соединения различного строения, в том числе углеводороды (алифатические, нафтеновые, ароматические) и фталаты (Бачурин, Одинцова, 2006).

Метод накопительных культур

Для выделения штаммов микроорганизмов использовали метод накопительного культивирования. Образцы ТМО (1 г) были помещены в 250 мл

колбы со 100 мл минеральной среды Раймонда (МР), содержащей 3% NaCl (Розанова, Назина, 1982). В качестве единственного источника углерода и энергии был использован орто -фталат (1 г/л). Инкубация проводилась в течение двух недель на термокачалке (100 об./мин.) при температуре 28 ° С. Из накопительных культур путем высева на агари-

СОО(СН,)„СН3

зованную МР (АМР), содержащую 1 г/л орто фталата, выделяли чистые культуры микроорганизмов. Чистота культур контролировалась путем высева на агаризованную богатую среду Раймонда (АБР), в составе которой присутствуют триптон (5,0 г/л) и дрожжевой экстракт (2,5 г/л).

СОО(СН,)„СН3

СОО(СН2)„.2СНз

СОО(СН2)П.2СН3

СОО(СН2)3СНз

СОО(СН2)зСНз

Фталат с длинной алкильной цепью

Фталат с короткой алкильной цепью

Дибутил фталат

СОО(СН2)лСНз

,СООСН2СН3

С ООН

Моно-эфир фталевой кислоты

^^сэон

Мон о этил фталат

COOCH2CH3

СООСН2СН3

Ди этил фталат

СООН

'^^^'ССХЗН

Фталевая кислота

СООСН2СН<

СООСН3

СООСНз

Этил-метил фталат

ОЗОН

СООСН3

СООСНз

Монометил фталат

Ди метил фталат

Рис. 1 . Пути бактериальной деградации фталатов (Liang et al., 2008)

Изучение физиологических и биодеградативных свойств бактерий

Устойчивость бактерий к повышенной солености среды (концентрация NaCl от 3 до 15%) определяли при культивировании на АБР и АМР ( орто -фталат, 1 г/л). При изучении биодеградативных свойств бактерии выращивали на АМР (концентрация NaCl 3%), используя в качестве единственного источника углерода и энергии одно из следующих соединений: пара -гидроксибензойную кислоту (ПГБК), протокатеховую кислоту (ПКК), салицилат, бензоат, гентизат, орто -фталат (концентрация в среде 1 г/л); а также нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол (бактерии выращивали в парах, добавляя вещества на крышку перевернутой чашки Петри). Рост бактерий на агаризован-ных средах учитывали на седьмые сутки. Оценка роста проводилась по формированию колоний: слабый рост «+» – колонии размером менее 1 мм; средний рост «++» – колонии размером 1–2 мм; хороший рост «+++» – колонии размером более 3

Ростовые характеристики штаммов-деструкторов изучали в жидкой минеральной среде Раймонда с 3% NaCl и орто -фталатом (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии. Штаммы выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в 50 мл минеральной среды при температуре 28 ° С и аэрации на шейкере со скоростью 120 об./мин. Оптическую плотность культур измеряли на спектрофотометре BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 540 нм.

Типирование и таксономическое положение изолированных штаммов

Типирование бактериальных штаммов проводили методом REP-ПЦР и ВОХ-ПЦР (Versalovic, 1994). Продукты реакции разделяли при электрофоретической разгонке в 1,5% агарозном геле, приготовленном на 1 х ТВЕ буфере (Маниатис и др., 1984).

Предварительную идентификацию изолятов осуществляли на основании изучения их морфологических, биохимических свойств (Определитель мм.

бактерий Берджи, 1997; Методы общей бактериологии, 1983), а также путем анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК исследуемых бактерий.

Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, амплифицированных с использованием универсальных бактериальных праймеров (Гавриш и др., 2004), проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBAСE 1000 (JSC GE «Healthcare», США). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК изучаемых изо-лятов сравнивали с нуклеотидными последователь- ностями типовых штамммов близкородственных видов из баз данных GenBank (http://www. и EzTaxon .

Результаты и анализ

Выделение, типирование и идентификация изолятов

Из образцов ТМО методом накопительного культивирования было выделено восемь штаммов бактерий, отличавшихся морфологическими и биохимическими признаками (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика штаммов бактерий, выделенных из ТМО

Штамм	Морфология колоний	Морфология клеток	^ Й ^ Щ H O sgS lls	сё К „ Й к й § Н	2
КТ112-7	Светло-розовые, круглые, гладкие, неблестящие, размер 1–3 мм	Мелкие кокки, одиночные/ пары/ цепочки	+	+	–
КТ1131	Светло-розовые, круглые, гладкие, блестящие, размер 2–3 мм	Кокки, одиночные/ па-ры/цепочки (4, 8 клеток)	+	+	–
КТ1132	Светло-желтые, круглые, гладкие, блестящие, размер 2–4 мм	Мелкие одиночные кокки	–	+	–
КТ15412	Светло-розовые, круглые, гладкие, блестящие, размер1–2 мм.	Кокки, одиночные/пары/ цепочки из 4 клеток	+	+	–
КТ1612	Желто-оранжевые, округлые, с неровным краем, размер 2–3 мм.	Мелкие палочки, подвижные	–	+	–
РО2	Кремовые, округлые, с неровным краем, блестящие, размер 4–8 мм.	Мелкие палочки, подвижные	+	+	–
РО11	Светло-розовые, круглые, гладкие, блестящие, размер 1–2 мм.	Кокки, одиночные/пары/ цепочки из 4 клеток	+	+	–
РО12	Ярко-оранжевые, круглые, гладкие, блестящие, размер 1–2 мм.	Мелкие кокки, одиночные/ пары/ цепочки из 4 клеток	+	+	–

Проведена сравнительная характеристика выделенных штаммов с использованием методов REP-ПЦР и ВОХ-ПЦР. Анализ полученных REP-ПЦР профилей фрагментов геномной ДНК исследуемых штаммов показал, что грамположительные штаммы КТ112-7, КТ15412, КТ1131, характеризующиеся сходными морфологическими признаками (табл. 1), принадлежат к трем геномогруппам (рис. 2А). Штамм КТ1131 имеет подобный ПЦР-профиль со штаммом КТ81, изолированным из нафталиновой накопительной культуры (данные не приводятся), что предполагает идентичность выделенных штаммов.

Анализ ВОХ-ПЦР профилей подтвердил принадлежность штаммов КТ112-7 и КТ1131 к гено-могруппам I и II соответственно. Фингерпринт грамотрицательного штамма КТ1612 имеет значительные отличия от таковых грамположительных изолятов (рис. 2Б).

У штаммов КТ112-7, КТ1131 (геномогруппы I и II), КТ1612 и PO2 были определены нуклеотид- ные последовательности фрагмента гена 16S рРНК (табл. 2).

Таким образом, штаммы-деструкторы орто фталата из ТМО, сформировавшихся в шламоот-стойниках соледобывающего производства, характеризуются таксономическим разнообразием: выявлены актинобактерии рода Rhodococcus, споровые бактерии рода Bacillus и протеобактерии рода Pseudomonas.

Устойчивость бактерий-деструкторов к повышенной солености среды

Бактерии способны к росту как при отсутствии в среде хлорида натрия, так и при повышенной солености (табл. 3), на основании чего они были отнесены к галотолерантным/галофильным микроорганизмам (Кашнер, 1981). Так, пять штаммов росли в диапазоне концентраций NaCl от 0% до 6%, штамм Pseudomonas sp. КТ1612 – до 7%, грамположительный штамм КТ15412 – до 8%, а штамм Bacillus sp. РО2 – до 15% соли на богатой агаризованной среде Раймонда.

1    2    3   4 M             Ml 1 2   3 4   5 М2

1 – КТ1131; 2 – КТ112-7; 3 – КТ15412; 4 – КТ81 (штамм-деструктор нафталина); M – маркер Gene Ruler DNA Ladder Low Range («Fermentas», Литва)

Рис. 2 . (А) Электрофореграмма продуктов REP-ПЦР штаммов-деструкторов:

(Б) Электрофореграмма продуктов ВОХ-ПЦР штаммов-деструкторов:

М1 – pUC19 DNA/MspI ( Hpa II) Marker, 23 («Fermentas», Литва); 1, 2, 3 – клоны штамма КТ112-7; 4 – КТ1131; 5 – КТ1612; M2 – маркер Gene Ruler DNA Ladder Low Range («Fermentas», Литва)

Таблица 2

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий-деструкторов орто -фталата

Штамм	Размер нуклеотидной последовательности, п.н.	Типовые штаммы из международной базы данных GenBank	Сходство (%)
КТ112-7	1400	Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T	100
КТ1131	682	Rhodococcus erythropolis NBCC 100887 T	99,7
КТ1612	885	Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T	98,1
PO2	568	Bacillus marisflavi TF-11T	99,4

На минеральной агаризованной среде с орто фталатом в качестве субстрата исследуемые штаммы росли как без добавления соли, так и при содержании хлорида натрия в среде: штамм

КТ1132 – до 3%, штаммы КТ112-7, КТ1131, КТ15412, КТ1612, РО11 – до 6%, штаммы РО2 и

РО12 – до 9% соли (табл. 3).

Таблица 3

Рост бактерий в присутствии различных концентраций хлорида натрия

Штамм

Концентрация NaCl (%), среда АБР

Концентрация NaCl (%), АМР, орто -фталат

Без NaCl

3

5

6

7

8

9

10

12

15

Без NaCl

3

6

9

КТ112-7

++

+++

+++

++

–

–

–

–

–

–

+++

+++

++

–

КТ1131

++

+++

+++

++

–

–

–

–

–

–

+++

++

++

–

КТ1132

++

+++

+++

++

–

–

–

–

–

–

+++

++

–

–

КТ15412

++

+++

+++

+++

+++

+

–

–

–

–

+++

++

++

–

КТ1612

++

+++

+++

+++

++

–

–

–

–

–

++

++

++

–

РО2

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

++

+

РО11

+++

+++

+++

++

+

–

–

–

–

–

+++

+++

++

–

РО12

+++

+++

+++

++

–

–

–

–

–

–

++

+++

++

–

Примечание. «+» – слабый рост; «++» – средний рост; «+++» – хороший рост; «–» – отсутствие роста бактерий.

Деструкция ароматических углеводородов изолированными бактериями

Исследуемые штаммы были выделены из накопительных культур, где орто- фталат добавлялся в качестве субстрата. Показано, что максимальная оптическая плотность (ОП 540 ) индивидуальных культур (штаммов КТ1131, КТ1132, КТ15412), растущих в жидкой минеральной среде Раймонда на орто -фталате, составляла 0,2 о.е. Наиболее эффективный рост при перечисленных выше условиях наблюдался у штамма КТ112-7 (ОП 540 = 0,85 о.е.).

Микробная деструкция многих полиароматиче- ских соединений осуществляется через образование орто-фталевой кислоты (Seo et al., 2009). Нами было установлено, что выделенные бактерии-деструкторы способны к росту на различных ароматических углеводородах и продуктах их разложения (табл. 4). Все культуры росли на бензоле, толуоле, феноле, пара-гидроксибензойной и про-токатеховой кислотах. Активный штамм-деструктор орто-фталата КТ112-7, в отличие от других штаммов, обладает наиболее широкой субстратной специфичностью и характеризуется интенсивным ростом на бифениле, нафталине, бензоате, гентизате (табл. 4).

Таблица 4

Рост бактерий на различных ароматических углеводородах

Штамм	Субстрат
	Бензол	Толуол	Фенол	Биф.	Наф.	Бензоат	Сал.	Гент.	ПГБК	ПКК
КТ112-7	+++	++	+++	+++	+++	+++	–	+++	+++	++
КТ1131	++	++	+++	+++	–	–	+	++	++	+++
КТ1132	++	++	++	+	–	н.о	–	++	н.о	+++
КТ15412	+++	++	+++	–	–	+++	+	+++	+++	+++
КТ1612	++	+++	+++	+	+	+	–	–	+++	+++
РО2	++	+++	+++	+	+	+	+	–	+++	+++
РО11	++	++	+++	+	+	+++	+	++	+++	+++
РО12	+	++	++	–	–	+++	++	++	+++	++

Рост бактерий: «+» – слабый, «++» – средний, «+++» – хороший; «–» – отсутствие роста; Биф. – бифенил; Наф. – нафталин; Сал. – салицилат; Гент. – гентизат, ПГБК – пара -гидроксибензойная кислота; ПКК – протокатеховая кислота.

Заключение

В исследуемых образцах техногенноминеральных образований района разработок Верхнекамского месторождения солей обнаружены грамположительные и грамотрицательные бактерии-деструкторы орто -фталата, отличающиеся по физиологическим, деструктивным характеристикам и таксономическому положению. На основании фенотипических и генетических особенностей четыре изолята были отнесены к родам Rho-dococcus , Pseudomonas , Bacillus . Было показано, что исследуемые штаммы являются галотолерант-ными/галофильными бактериями и, кроме того, штаммы рода Rhodococcus способны использовать орто -фталат как единственный источник углерода и энергии в условиях повышенной солености среды (при содержании NaCl до 9%). Полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего исследования выделенных бактерий, в том числе с целью изучения возможности их использования при очистке засоленных почв, грунтов, водоемов от стойких органических загрязнителей (фталатов, полиароматических углеводородов).

Работа поддержана Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», проект «Исследование метаболизма токсичных органических соединений у аэробных бактерий, анализ генетических и ферментных систем биотрансфор- мации» (ГР №01200963682), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».