Бактерии-деструкторы полихлорированных бифенилов из почв с различным уровнем загрязнения

Процессы естественной селекции бактерий с теми или иными свойствами протекают в почвах непрерывно. При этом направление отбора зависит от спектра и количества химических соединений, присутствующих в почве.

В настоящее время остро стоит проблема поиска бактериальных штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к стойким органическим загрязнителям (СОЗ). В группу СОЗ включены хлорароматические соединения, в частности полихлорированные бифенилы (ПХБ), линдан, гексахлорбензол, особо устойчивые к воздействию физических, химических и биологических факторов .

Анализ научных публикаций и собственные исследования показали, что бактериальная деструкция – это один из оптимальных способов утилизации данных соединений как с экологических, так и с экономических позиций [Unterman, 1996; Зана-вескин, Аверьянов, 1998; Pieper, 2005; Васильева, Стрижакова, 2007; Хоменков и др., 2008; Егорова и др., 2010; Егорова, Демаков, Плотникова, 2011; Егорова, Плотникова, 2011]. Однако для очистки обширных территорий от ПХБ и других СОЗ, перспективно применение штаммов, деструктивные свойства которых являются результатом естественного отбора в природных эконишах.

Цель работы – выделение и исследование штаммов-деструкторов хлорароматических веществ из районов с разной техногенной нагрузкой.

Материалы и методы исследования

Образцы почв. Почвы отбирали в районах, находящихся на значительном расстоянии друг от друга и отличающихся уровнем экологического благополучия:

• 1.    Образцы под шифром SSE были получены с территории, прилегающей к оз. Сульфатное Селен-гинского р-на республики Бурятия. 51°22'N106°35'E

• 2.    Образцы под шифром SBE – с территории, прилегающей к оз. Белое Иволгинского р-на республики Бурятия. 51°32'N107°1'E

• 3.    Образцы BP – с территории г. Березники, прилегающей к промышленным предприятиям, Пермский край. 59°28'N56°46'E

• 4.    Образцы СH – с территории предприятия ОАО СВЗХ, г. Чапаевск, Самарской обл.

52°59'N49°41'E

Формат координат: Ddd градусов mm минут ss.s секунд.

Все образцы отобраны по методу «конверта» с соблюдением правил асептики в радиусе 100 м от указанной точки. Для дальнейшего анализа брали усредненную пробу.

Анализ почв на загрязнение. Обработку проб почвы проводили по «Методике выполнения измерений массовой концентрации полихлорбифенилов в воздухе рабочей зоны, промвыбросах, природных и сточных водах и почвах методом газожидкостной хроматографии» № 88-16358-25-2000. Условия хроматографирования.

ГХ-ПИД условия : газовый хроматограф «Shimadzu GC 2010», с пламенно-ионизационным детектором, кварцевой капиллярной колонкой ZB-5 длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм. Начальная температура колонки 40°С (выдержка 3 мин.), далее нагрев со скоростью 10°С/мин. до 280°С (выдержка 30 мин.). Температура испарителя 250°С, детектора 300°С. Газ-носитель – азот, деление потока 1:30, расход через колонку 1.0 мл/мин. Вводили 1.0 мкл.

ГХ-ЭЗД условия : газовый хроматограф «Shi-madzu GC 2010Plus», с электроно-захватным детектором, кварцевой капиллярной колонкой GsBP-5MS длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм. Начальная температура колонки 40°С (выдержка 3 мин.), далее нагрев со скоростью 10°С/мин., до 280°С (выдержка 30 мин.). Температура испарителя 250°С, детектора 300°С. Газ-носитель – азот, деление потока 1:30, расход через колонку 1.0 мл/мин. Вводили 1.0 мкл.

ГХ-МСД условия: газовый хроматограф-масс-спектрометр «Agilent GC 7890A MS 5975C Inert XL EI/CI» с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм.; электронная ионизация (70 эВ); сканирование по полному ионному току в интервале m/z 20–1000 Da; газ-носитель – гелий, деление потока 1:50, расход через колонку 1.0 мл/мин.; температура колонки – начальная 40°С (выдержка 3 мин.), программирование со скоростью 10°С/мин. до 290°С (выдержка 30 мин.), температура испарителя – 250°С, температура источника – 230°С, квадруполя – 150°С, переходной камеры – 280°С. Вводили 1.0 мкл.

Идентификацию компонентов проводили на основании базы масс-спектров NIST05 и калибровочных хроматограмм ГСО 7821-2000 «Совол».

Штаммы-деструкторы. В работе использованы штаммы, осуществляющие разложение одного или нескольких хлорароматических соединений: Microbacterium oxydans B51 [Рыбкина и др., 2003],

Rhodococcus erytropolis B7a [Егорова и др., 2010], Rhodococcus sp. Ch628 и Pseudomonas sp. SBE14a (настоящее исследование).

Выделение штаммов-деструкторов проводили двумя методами: методом накопительного культивирования, как описано [Рыбкина и др., 2003], и прямого высева на минеральную среду с бифенилом, в качестве источника углерода и энергии. Для выделения и роста бактерий-деструкторов из образцов BP и CH использовали минеральную среду К1 [Зайцев, Карасевич, 1981], для образцов SSE и SSВ – минеральную среду АММ [Заварзина и др., 2006].

Для получения агаризованной среды добавляли агар до конечной концентрации 1.5%. При выращивании бактерий на агаризованных средах бифенил добавляли на крышку чашки Петри.

Определение таксономического положения изолированных штаммов. Морфологические признаки микроорганизмов изучали по общепринятым методикам [Методы…, 1983; Методы…, 1991]. Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F и 1492R [Tiirola et al., 2002]. Секвенирование продуктов амплификации осуществляли с помощью набора реактивов DYEnamic ET Dye Terminator Cycle sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic analyser 3500XL (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программ CLUSTAL W [Thompson, Higgins, Gibson, 1994], TREECON [van de Peer, DeWachter, 1994], BLAST . Поиск гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank и EzTaxon .

Ростовые характеристики штаммов изучались в жидкой минеральной среде К1 [Zaitsev et al., 1991] или АММ [Заварзина и др., 2006]. Штаммы выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в 100 мл минеральной среды при температуре 28^оС и аэрации на шейкере со скоростью 220 об/мин. В качестве субстрата использовали бифенил в концентрации 1 г/л. Рост контролировали по изменению оптической плотности среды, измерение проводили на спектрофотометре Shimadzu BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм.

Деструкцию соединений группы СОЗ проводили, как описано [Егорова и др., 2010].

Продукты деградации хлорбифенилов (ХБ) определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Shimadzu BioSpec-mini) и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (хроматограф Shimadzu LC-20A, детектор Shima- dzu RF-20A, колонка Discovery C18 (150 x 4.6 мм) («Supelco», «Sigma-Aldrich», США)), как описано [Егорова и др., 2011]. Эксперименты с «отмытыми клетками» проводили аналогично экспериментам Д.О. Рыбкиной и др. [Рыбкина и др., 2003].

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Анализ почв, отобранных на территории г. Березники делены и описаны активные штаммы-деструкторы полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот – Microbacterium oxydans B51 [Рыбкина и др., 2003] и Rhodococcus erytropolis B7a [Егорова и др., 2010]. Способность данных штаммов к разложению веществ группы СОЗ, в частности полихлорированных бифенилов, позволила предположить, что естественная селекция данных штаммов протекала в условиях специфического химического загрязнения.

Анализ образцов почв в условиях газовой хроматографии с применением различных детекторов показал наличие широкого спектра галогенированных ароматических и циклических соединений, а также алифатических углеводородов (рис. 1, табл. 1).

В результате ранее проведенных исследований

Рис. 1 . Хроматограммы усредненного образца почвы ВР с применением различных детекторов:

а – условия ГХ-ПИД, б – условия ГХ-ЭЗД

Таблица 1

Основные загрязнители, выявленные в усредненном образце почвы ВР 4

Время удерживания, мин		Название	Брутто-формула	Молек. масса	Структура
ПИД	ЭЗД
18.524	18.964	Pentadecane Benzene, tribromo-	C15H32 C6H3Br3	212 312	Br Br Br
19.725		Hexadecane	C16H34	226	Линейный углеводород
20.874	21.853	Thiophene, tetrabromo-	C4Br4S	396	Br          S           Br Br             Br
20.941		Heptadecane,	C17H36	230	Линейный углеводород
21.112	22.237	Dibromobenzo(b)thiophene	C8H4Br2S	290	S Br
21.853	22.639	Benzene, tetrabromo-	C6H2Br4	390	Br Br Br Br
22.134	22.991	Naphthalene, dibromo-	C10H6Br2	284	Br           Br

Окончание табл. 1

Время удерживания, мин		Название	Брутто-формула	Молек. масса	Структура
ПИД	ЭЗД
22.221	23.061	Naphthalene, dibromo-	C10H6Br2	284	Br           Br
	23.299	Naphthalene, dibromo-	C10H6Br2	284	Br           Br
22.869	23.394	Benzene, tetrabromo-	C6H2Br4	390	Br Br Br Br
23.014		Nonadecane	C19H40	268	Линейный углеводород
23.689	24.307	Dibutyl phthalate	C16H22O4	278	O OO O
24.013		Eicosane	C20H42	282	Линейный углеводород
24.316		18-Norabietane	C19H34	262
	25.614	1,1'-Biphenyl, dibromo-	C12H8Br2	310	Br ^оуУ(5у- Br
24.968		Heneicosane	C21H44	296	Линейный углеводород
25.883		Docosane	C22H46	310	Линейный углеводород
	27.380	DDE - Benzene, 1,1'-(dichloroethenylidene)bis[4-chloro- 2,4,6-Tribromobiphenyl	C14H8Cl4 C12H7Br3	316 388	Cl          Cl ууу Cl                                               Cl Br Br          Br          Br
26.761		Tricosane	C23H48	324	Линейный углеводород
27.385	29.315	p,p'-DDT	C14H9Cl5	352	Cl                                               Cl IC^JOJ Cl Cl           Cl
27.643		Tetracosane	C24H50	338	Линейный углеводород
28.610		Pentacosane	C25H52	352	Линейный углеводород
29.387		Di-n-octyl phthalate	C24H38O4	390	O OO O
29.708		Hexacosane	C26H54	366	Линейный углеводород
30.985		Heptacosane	C27H56	380	Линейный углеводород
32.500		Octacosane	C28H58	394	Линейный углеводород

Штаммы Microbacterium oxydans B51 и Rhodococcus erytropolis B7a осуществляли разложение моноароматических соединений, таких как бензол, толуол и ряд других, отличающихся типом и количеством заместителей в кольце [Рыбкина и др., 2003, Егорова и др., 2010]. Как видно из полученных данных, в почве присутствуют производ- ные бензола и фталевой кислоты (табл. 1). Таким образом, наличие данных соединений способствовало естественной селекции штаммов, обладающих ферментными системами окисления ароматических веществ.

Среди выявленных в ВР-образцах загрязнителей высока доля соединений, состоящих из двух ароматических колец. Известно, что разложение таких веществ происходит в результате ферментативного окисления кольца молекулы [Pieper, 2005, Solyanikova et al., 2008]. При этом в случае присутствия нескольких соединений, близких по структуре, в клетках бактерий могут активироваться уникальные сочетания ферментативных путей. Следует отметить, что штаммы Microbacterium oxydans B51 и Rhodococcus erytropolis B7a характеризуются высокой деструктивной активностью по отношению к полихлорированным бифенилам и их химически модифицированным производным, а также обладают уникальным сочетанием ферментов, обусловливающих окисление сложных ароматических соединений [Рыбкина и др., 2003, Егорова и др., 2010; Егорова, Демаков, Плотникова, 2011; Егорова, Плотникова, 2011].

Для дальнейших исследований были отобраны образцы почв на двух территориях, отличающихся по уровню экологического благополучия.

Анализ образцов почв с территории республики Бурятия

Районы оз. Сульфатное и Белое республики Бурятия являются экологически благополучными.

Газохроматографический анализ с применением трех возможных детекторов не выявил загрязнения в почвах Селенгинского р-на (образцы SSE). В образцах SBE из Иволгинского р-на обнаружены в следовых количествах гексахлорбензол и линдан, входящие в группу СОЗ и являющиеся инсектицидами (табл. 2).

Таблица 2

Основные загрязнители, выявленные в почвах образцов SBE

Время удерживания, мин.		Название	Брутто-формула	Молек. масса	Структура
ПИД	ЭЗД
21.499	22.278	Benzene, hexachloro-	C6Cl6	282	Cl Cl                     Cl Cl                     Cl
22.680	22.786	Lindane	C6H6Cl6	288	Cl         Cl        Cl Cl                     Cl Cl

Выделение штаммов-деструкторов из образцов почв с территории республики Бурятия

Из образцов почв SSE ни одним из использованных способов не удалось получить штаммы, способные расти на минеральной среде с бифенилом в качестве единственного источника углерода и энергии.

Методом накопительного культивирования в минеральной среде с бифенилом с последующим рассевом до единичных колоний из образцов SВE получено 1.5 х 10 6 КОЕ/г почвы. Все колонии были разделены на 2 морфотипа:

• а)    колонии округлые диаметром 3 мм, поверхность гладкая, блестящая, профиль выпуклый, прозрачные, бесцветные, край ровный, структура однородная;

• б)    колонии округлые диаметром 2–3 мм, поверхность гладкая, блестящая, профиль выпуклый, прозрачные, цвет бледно-желтый, ровный край, однородная структура.

Представители морфогрупп были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Показано, что среди обнаруженных бактерий присутствуют представи- тели родов Achromobacter, Pseudomonas и Halomonas.

Для дальнейших исследований был отобран штамм SBE14а. У данного штамма определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК длиной 1412 п.н. и проведено сравнение с гомологичными последовательностями, имеющимися в международных базах данных GenBank/EMBL/DDBJ и на сервере EzTaxon . Выявлена филогенетическая близость исследуемого штамма с типовым штаммом Pseudomonas stutzeri CCUG11256T (GenBank U26262). На настоящем этапе исследования штамм идентифицирован как Pseudomonas sp.

Исследование ростовых характеристик показало, что штамм Pseudomonas sp. SBE14а активно растет в жидкой минеральной среде (максимальная оптическая плотность составляла ОП 600 =0.78 оп.ед.) и использует незамещенный бифенил как источник углерода и энергии. Однако штамм не проявлял деградативной активности к хлорированным бифенилам.

Таким образом, из почв с низким уровнем загрязнения хлорароматическими соединениями не удалось выделить активных штаммов-деструкторов.

Анализ образцов почв с территории г. Чапаевск

Город Чапаевск с 1999 г. признан зоной экологического бедствия . На его территории находятся предприятия, на которых длительное время производили вещества хлорароматического ряда.

В ходе данной работы проведен анализ почвы, отобранной на территории предприятия, производившего широкий спектр химических соединений (рис. 2, табл. 3).

Рис. 2 . Хроматограмма усредненной пробы почв образцов СН

Таблица 3

Основные загрязнители, выявленные в усредненной пробе образцов СН

Время удерживания, мин.		Название	Брутто-формула	Молек. масса	Структура
ПИД	ЭЗД
21.499	22.278	Benzene, hexachloro-	C6Cl6	282	Cl Cl                   Cl Cl                   Cl
22.680	22.786	Lindane	C6H6Cl6	288	Cl          Cl        Cl Cl                     Cl Cl
	26.482 – 32.798	Polychlorobiphenyl (mix)	C 12 H n Cl m		Cl Cl                Cl Cl                Cl Cl                Cl дод Cl                Cl Cl

При анализе в условиях ГХ-ПИД на хроматограммах образцов почвы регистрируется пики соединений, соответствующие смеси углеводородов С 17 -С 25 , дибутил- и диоктилфталатам. При регистрации в условиях ГХ-ЭЗД на хроматограммах регистрируются пики ПХБ, гексахлорбензола и линдана (γ-гексахлор-циклогексан).

Количественная оценка показала, что содержание данных веществ в почве превышает допустимые нормы (табл. 4).

Таблица 4

Содержание веществ группы СОЗ в образце почвы СН

Соединение	ПДК, мг/кг	В образце СН, мг/кг
гексахлорбензол	0.03	0.816
линдан	0.1	5.468
смесь ПХБ	0.06	0.408

Выделение штаммов-деструкторов из образцов почв г. Чапаевска

Методом прямого высева установлено, что в образцах почвы СН в значительном количестве присутствуют бактерии, способные расти на мине- ральной среде с бифенилом (8.6 х 106 КОЕ/г почвы).

Методом накопительного культивирования с последующим рассевом до единичных колоний из образцов СН получено 25.9 х 10⁶ КОЕ/г почвы, способных использовать бифенил в качестве ростового субстрата. Выделено две доминирующие группы бактерий, отличающихся морфологией колоний. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал принадлежность основных представителей данных морфогрупп к родам Pseudomonas и Rhodococcus.

Для дальнейшего исследования отобран штамм Сh628. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК длиной 1390 п.н. и сравнение с гомологичными последовательностями выявил филогенетическую близость исследуемого штамма с типовым штаммом Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082^T (GenBank Z37138).

При культивировании штамма Сh628 в жидкой минеральной среде с бифенилом установлено, что максимальная оптическая плотность культуры составляет ОП 600 =0.299 оп.ед. и достигается за 72 ч.

Установлено, что штамм Rhodococcus sp. Ch628 проявляет высокую активность к хлорированным бифенилам (табл. 5).

Штамм Ch628 осуществляет почти 100%-ное разложение моно- и дихлорированных бифенилов за 48 ч. Несколько ниже показатель при разложении трихлорированных бифенилов. Следует отметить, что исследуемый штамм разрушает не только отдельные хлорбифенилы, но и их промышленные смеси (табл. 5). Подобная деградативная активность описана для ограниченного круга бактериальных штаммов-деструкторов [Pieper, 2005; Ade-busoye et al., 2007; Егорова и др., 2010].

Таблица 5

Разложение хлорированных бифенилов и их промышленных смесей штаммом Rhodococcus sp. Ch628

ПХБ	Время деструкции, сут	Концентрация ПХБ, мг/л	Промежуточные продукты
			ГОФДК, ОП 397	ХБК, мг/л	(ОН)БК, мг/л
	0	18.9±0.02	Н.О.	Н.О.	Н.О.
2ХБ	1	0.51±0.02	Н.О.	0.41±0.02	2.79±0.02
	2	0.05* ±0.01	Н.О.	0.46±0.01	2.77±0.01
	0	18.9±0.03	Н.О.	Н.О.	Н.О.
4ХБ	1	0.936±0.02	Н.О.	0.09±0.02	0.08±0.01
	2	0.59±0.01	Н.О.	0.11±0.01	0.16±0.01
	0	22.3±0.02	Н.О.	Н.О.	Н.О.
2,4'-ХБ	1	2.29±0.04	0.612±0.002	0.01±0.03	0.42±0.02
	2	0.17±0.01	0.465±0.001	0.02±0.01	0.57±0.03
	0	12.9±0.03	Н.О.	Н.О.	Н.О.
2,4,4'-ХБ	1	4.79±0.02	0.289±0.001	0.001±0.0002	0.11±0.01
	2	2.88±0.01	Н.О.	0.002±0.0001	0.08±0.01
	0	12.9±0.02	Н.О.	Н.О.	Н.О.
2,4,2'-ХБ	1	5.77±0.04	Н.О.	0.003±0.0003	0.12±0.01
	2	5.16±0.01	Н.О.	0.005±0.0001	0.11±0.01
	0	0.13±0.03	Н.О.	Н.О.	Н.О.
«Делор 103»	5	0.034 ±0.02	0.869±0.001	0.09±0.02	0.03±0.01
	8	0.003 ±0.01	1.167±0.002	0.12±0.01	0.06±0.01
	0	0.55±0.02	Н.О.	Н.О.	Н.О.
«Совол»	5	0.016 ±0.04	Н.О.	0.14±0.03	Н.О.
	8	0.005 ±0.01	0.270±0.001	0.31±0.01	Н.О.

Примечание. Н.О. – не обнаружено, «*» - жирным шрифтом выделены концентрации ниже значения ПДК.

Показано, что штамм Rhodococcus sp. Ch628 способен разлагать и ряд других соединений группы СОЗ (табл. 6). Так как данные вещества особо устойчивые как к химическому, так и к биологическому разложению, то уровень деструкции, показанный данным штаммом, несомненно, является значимым.

Таблица 6

Разложение соединений группы СОЗ штаммом Rhodococcus sp. Ch628

Вещество	Начальная концентрация, мкг/мл	Концентрация через 4 сут., мкг/мл	Деструкция, %
Хлорбензол	10±0.1	0	100
Линдан	0.2±0.01	0.15±0.01	20.7
ГХБ	2.5±0.02	1.95±0.01	21.8
ДДТ	0.2±0.01	0.13±0.01	30.5

Таким образом, штамм Rhodococcus sp. Ch628 обладает уникальным сочетанием деградативных свойств в отношении ряда соединений группы СОЗ.

Заключение

Загрязнение галогенароматическими углеводородами различных территорий является важным фактором в процессах естественного отбора групп бактерий, способных к разложению одного или нескольких веществ группы СОЗ.

В результате проведенных исследований установлено, что наиболее активные штаммы-деструкторы полихлорированных бифенилов, обладающие уникальным сочетанием ферментативных путей, выделены из почв, длительное время загрязненных галогенароматическими углеводородами. Показано, что штамм Rhodococcus sp. Ch628, способный эффективно разлагать смеси ПХБ и ряд других СОЗ, выделен из почв с высоким уровнем загрязнения данными веществами, а штаммы Microbacterium oxydans B51 [Рыбкина и др., 2003] и Rhodococcus erytropolis B7a [Егорова и др., 2010] – из почвы, загрязненной различными галогенароматическими и алифатическимим углеводородами. Напротив, в почвах из экологически чистого района не удалось обнаружить бактериальные штаммы с искомыми свойствами.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №14-04-96021р_урал_а.