Бактериоцины молочнокислых бактерий

Антимикробный эффект молочнокислых бактерий издавна использовался для продления срока годности пищевых продуктов [1]. Классические работы Л. Пастера открыли первые страницы в изучении этой группы микроорганизмов [2]. По мнению ряда исследователей, образование органических кислот (молочной и уксусной) из углеводов приводит к снижению рН среды и предотвращает развитие других микроорганизмов [3]. Кроме того, бактерицидным действием на специфические группы микроорганизмов, включая патогенные формы, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие энтеротоксины, обладают белковые вещества, выделяемые некоторыми видами бактерий - бактерио-цинов [4].

Бактериоцины представляют собой комплекс пептидов с молекулярной массой от 2 до 35 кДа, существенно отличающихся друг от друга по физико-химическим характеристикам и биологическим эффектам [6, 7]. Выявлено, что на проявление антагонистической активности бактериоцинов, продуцируемых молочнокислыми бактериями, влияют температура, электрическое поле, рН, состав, консистенция среды, присутствие Ca2+ и Mg2+ и другие факторы [7, 8, 9].

К числу общих свойств бактериоцинов относится их чувствительность к температуре, хотя это свойство также может варьировать в широких пределах. Некоторые разрушаются при температуре 48-50 ° С, другие кратковременно выдерживают температуру 60-70 ° С, а отдельные сохраняют активность даже при 100 ° С. Низин выдерживает кипячение до 120 ° С без потери активности.

Бактериоцины чувствительны к воздействию протеаз и имеют различный молекулярный вес (30000-100000 Да). Белок бактериоцина связан с липополисахаридом клеточной оболочки, но только белковая часть молекулы обладает антибактериальной активностью [11, 12].

На основании физико-химических свойств, аминокислотного состава, способов выведения, а также антимикробного спектра действия бактериоцины энтерококков различные исследователи разделяют на три класса: I, II, III [8, 13, 14].

Бактериоцины I класса

К первому классу бактериоцинов относятся лантибиотики, низкомолекулярные катионные, гидрофобные, устойчивые к нагреванию пептиды, в состав которых входят такие редкие тиоэфирные аминокислоты, как лантионин и Р —метиллантионин, дегидроаланин, дегидробутирин, и несколько тиоэфирных мостиков, которые замещают дисульфидные связи и придают этим белковым соединениям некоторую полициклическую структуру [6].

К этой группе относятся низины, образуемые Lactococcus (Streptococcus) lactis , эпидермин, галлидермин, продуцентом которого является St. gallinarum , а также субтилин (B. subtilis).

Примером первого класса бактериоцинов является низин - лантибиотик, секретируемый бактериями Lactococcus lactis . Содержит 34 остатка аминокислот (из них 30 остатков кислот (Lis, His, Asp, Ser, Pro, Gli, Ala, Val, Met, Ile, Leu), а также остатки редко встречающихся серосодержащих аминокислот: лантионина, р —метиллантионина и ненасыщенных аминокислот дегидроаланина и Р —метилдегидроаланина. Низин обладает бактерицидным действием на грамположительные микроорганизмы: стрептококки различных серологических групп, стафилококки, пневмококки, микобактерии, споровые - аэробные и анаэробные бактерии. Обладая способностью адсорбироваться на поверхности спор чувствительных к нему спорообразующих микроорганизмов, низин нарушает проницаемость спор, снижает устойчивость спор к воздействию высоких температур. Из аэробных споровых бактерий рода Bacillus к низину наиболее чувствительны Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. cereus , вызызвающие порчу молочных продуктов. Также чувствительны к действию низина споровые анаэробы рода Clostridium (Budde, Rasch, 2001) .

Бактериоцины II класса

Большинство бактериоцинов относится ко II классу. Представляют собой низкомолекулярные катионные термостабильные пептиды, сохраняющие свою активность при широком диапазоне рН (3–9), слабо иммуногенные и нетоксичные для человека и животных [6, 20, 21]. Они вызывают повреждение цитоплазматической мембраны грамположительных бактерий, а по современным данным - и грамотрицательных бактерий [10, 21, 22, 23]. Бактериоцины II класса чаще всего синтезируются как препептиды, а затем без модификации их аминокислотных остатков, в процессе секреции из клетки продуцентов утрачивают свои лидирующие компоненты. Гены, необходимые для продукции бактериоцинов II класса (регуляторные, гены, кодирующие препептид (или пептид), обеспечивающие транспорт через мембрану и устойчивость бактерий к собственному антимикробному пептиду), располагаются в плазмидах или в хромосоме. Кроме того, гены бактериоцинов могут быть обнаружены в мобильных транспозоноподобных генетических модулях ДНК-содержащих бактериофагов [20].

Бактериоцины II класса по химическому строению, особенностям выведения из клетки продуцента, спектру антимикробной активности разделяют на 3 подкласса: IIa, IIb, IIc [11, 20, 25].

Бактериоцины подкласса IIа

Бактериоцины подкласса IIa наиболее хорошо изучены. Чаще всего их называют пе-диоциноподобными пептидами. Во время экспорта через клеточную мембрану от молекулы их препептидов отрезается N-терминальная лидирующая последовательность с двумя глициновыми аминокислотными остатками на конце [26]. После секреции из клетки эти бактерио-цины представляют собой пептиды с молекулярной массой до 10 кДа, образующие, как правило, один дисульфидный мостик. После попадания в окружающую среду бактериоцины данного подкласса атакуют клетку-мишень за счет электростатического гидрофобного взаимодействия с последующим проникновением внутрь чувствительной клетки. Для специфического распознавания бактериоцином клетки-мишени необходимо присутствие на ее клеточной мембране маннозопротеиновых рецепторов, являющихся частью фосфотрансфераз-ной системы. В то же время нельзя исключить, что подобное взаимодействие является необязательным условием для проявления антагонистической активности к бактериям, в том числе и рода Listeria [22]. При помощи C-части пептиды проникают в мембрану и действуют на клетку-мишень, что определяет антибактериальную активность и специфичность бактерио-цина. Показано, что степень проникновения зависит от заряда липосом, а также от расположения аминокислотных остатков в С-части молекулы бактериоцина. Бактериоцины IIa типа формируют ионоселективные поры в клетках-мишенях, вызывая выход из последних ионов калия, аминокислот и других низкомолекулярных веществ. Это приводит к изменению ионного баланса, уровня рН в клетке и последующей быстрой потере внутриклеточной АТФ [26].

Бактериоцины подкласса IIb

Бактериоцины этого подкласса для наличия высокой антибактериальной активности должны состоять из двух различных субъединиц или пептидов, действующих только вместе или раздельно как синергисты [10, 11, 20]. До настоящего времени, несмотря на способность проявлять антибактериальную активность самостоятельно и расположение в различных генах, эти вещества не были выделены.

Бактериоцины подкласса IIс

К подклассу IIc относятся однопептидные бактериоцины, не имеющие каких-либо свойств, характерных для IIa бактериоцинов.

Бактериоцины подкласса IId

Этот подкласс бактериоцинов выделяют немногие авторы [20], предлагая отдельно рассматривать пептиды с особенным строением. Примером такого белкового соединения является бактериоцин AS-48. Бактериоцин AS-48 - первый из выделенных, один из наиболее изученных бактериоцинов [6, 12, 18, 22]. Он является циклическим пептидом с молекулярной массой 7,2 кДа, представляет собой полипептидную цепь из 70 аминокислотных остатков, замкнутых в кольцо. Известно, что подобная молекула обладает высокой конформационной изменчивостью [20]. Это свойство позволяет молекуле бактериоцина AS-48 связываться с поверхностными структурами широкого спектра бактерий. Девять генов, необходимых для синтеза, модификации, секреции этого первоначально пребактериоцина, устойчивости к нему продуцента, образуют кластер в плазмиде pAD1 (59 кБ) [21].

Бактериоцины III класса

Бактериоцины этого класса представляют собой антимикробные чувствительные к изменениям температуры белки с молекулярной массой более 30 кДа, способные расщеплять муреин клеточной стенки. К их числу относится энтеролизин А.

Классификация бактериоцинов позволяет систематизировать наши знания о природе и механизмах действия соответствующих групп антимикробных пептидов. Это создает возможность осуществлять подбор антимикробных пептидов или их комбинаций для терапии и профилактики соответствующей инфекционной патологии [17].

43                    Вестник ВСГУТУ. № 2 (59). 2016

Механизм действия бактериоцинов

Учитывая большое разнообразие химического строения бактериоцинов, можно предположить, что они воздействуют на жизненно важные функции чувствительных клеток, но большинство действуют, образуя в мембране поры или каналы, способствующие нарушению мембранного потенциала чувствительных клеток [24, 25].

Анионные липиды цитоплазматической мембраны являются основными рецепторами бактериоцинов молочнокислых бактерий для стимуляции порообразования. Бактериоцины I класса могут вызывать формирование пор по типу клиноподобной модели, в то время как бактериоцины II класса способны функционировать, создавая поры, посредством которых пептиды располагаются параллельно мембранной поверхности и оказывают влияние на структуру мембран [36].

Наиболее хорошо изучен механизм действия бактериоцинов на примере низина (рис.).

При изучении действия низина стало ясно, что часть C-конца молекулы деполяризует цитоплазматическую мембрану, что ведет к мгновенной остановке синтеза компонентов клеточной стенки и всех биосинтетических процессов в клетке. Основной характер действия низина - это взаимодействие с отрицательно заряженными мембранами (билипидный слой), предпочтительно с мембранами, содержащими анионные липиды. Грамположительные бактерии имеют более высокие концентрации анионного липида в их цитоплазматической мембране по сравнению с грамотрицательными. Бактериоцин сначала связывает его C-конец с анионными липидами, после чего N-конец опускается в липид мембраны и пептид принимает параллельное положение на мембранной поверхности. И, в конечном счете, целый пептид имеет возможность переместиться по всей длине поры [24].

Рисунок - Механизм действия бактериоцинов

Низин ингибирует синтез муреина клеточной стенки. В результате действия антибиотика происходит накопление промежуточного липида, с которым низин образует прочный комплекс, что и приводит к остановке дальнейшего синтеза пептидогликана бактериальной стенки. Низин может вызывать лизис клеток вследствие необратимой деструкции клеточной мембраны, которая регулирует осмотическое давление клетки. Он изменяет поверхностное натяжение цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению клеточной проницаемости и, как следствие этого, к бактериальному лизису.

Перспективы применения бактериоцинов молочнокислых бактерий

Бактериоцин низин (имеет GRAS-cтатус – «признанный как безопасный», Е234), образуемый Lactococcus lactis, с успехом используют для увеличения сроков годности продуктов питания в пищевой промышленности многих стран уже более 50 лет. Низин впервые был ис- пользован в промышленном производстве как консервант в Великобритании для производства и сохранения сыров, и с этого момента его стали активно использовать в пище и напитках. В дальнейшем эффективность использования низина возможна вследствие его синер-гидного действия с хелатными и другими бактериоцинами как добавка в новые технологические процессы пищевой промышленности, при которых, возможно, будут пересмотрены режимы стерилизации при производстве консервов и пресервов для сохранения пищевой ценности продуктов [25].

Потребительский спрос на минимально обработанные пищевые продукты или «свежую еду» без химических консервантов стимулировал исследователей на поиск натуральных антимикробных средств [26]. Кроме того, бактериоцины, в отличие от антибиотиков, полностью расщепляются в организме, и вероятность возникновения осложнений от бактериоци-нов минимальна, а применение антибиотиков имеет для человека отрицательные последствия. Однако сферы применения известных форм бактериоцинов, как уже отмечалось, ограничены из-за низкой активности при нейтральных или щелочных значениях pH. Поэтому поиск бактериоцинов с улучшенными физико-химическими свойствами и широким антимикробным спектром представляет большой интерес не только для пищевой промышленности, но и для фармацевтической - при создании альтернативных антибиотиков, что является одной из самых актуальных проблем в области микробиологии и биотехнологии.