Бактеризация штаммом Bacillus amyloliquefaciens для повышения адаптивности микроклонов Mentha longifolia и Mentha spicata в условиях ex vitro

Введение. Согласно современным исследованиям, целенаправленное использование микробных инокулянтов на основе ризосферных и эндофитных бактерий ( Bacillus , Pseudomonas , Azospirillum ) представляет собой перспективный биотехнологический подход для повышения продуктивности растений [1, 2]. Эффективность этого подхода подтверждена для различных культур, включая ценные эфиромасличные растения, такие как тимьян обыкновенный, в условиях контролируемых агроэкосистем [3]. Данные биопрепараты показали свою результативность и в других направлениях защищенного грунта, например для стимуляции роста микрозелени кориандра посевного ( Coriandrum sativum L.) [4].

В отличие от широко культивируемой мяты перечной (Mentha×piperita), длиннолистная мята (Mentha longifolia L.) представляет значительный интерес как источник специфического эфирного масла с высоким содержанием пулегона и ментола, обладающего выраженными антимикробными, антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, что делает ее ценной для фармацевтики, косметологии и пищевой промышленности [5, 6]. Мята колосистая (Mentha spicata L.), в свою очередь, ценится за высокое содержание карвона и лимонена в эфирном масле, что определяет ее мягкий, сладковатый аромат и широкое применение в кондитерской отрасли, производстве напитков и парфюмерии [7, 8]. Однако традиционное веге- тативное размножение обоих видов ограничено низким коэффициентом размножения, сезонностью и высоким риском накопления вирусных и грибковых инфекций, снижающих выход и качество сырья. Клональное микроразмножение in vitro решает эти проблемы, обеспечивая получение генетически однородного, оздоровленного посадочного материала в неограниченных количествах независимо от сезона. Критическим технологическим барьером данной технологии для данных видов является этап адаптации микроклонов к нестерильным условиям (ex vitro), на котором наблюдается массовая гибель растений из-за стресса, вызванного резкой сменой влажности, освещения и микробного фона среды [9]. Универсальные протоколы, разработанные для мяты перечной, часто оказываются неэффективными для M. longifolia и M. spicata из-за их видовой специфики в темпах укоренения, формировании кутикулы, чувствительности к патогенам и реакции на условия.

Разработка эффективных протоколов сохранения in vitro является ключевым условием для включения мяты в селекционные программы и поддержания ее генетического разнообразия [10, 11]. Критически важным звеном таких протоколов является этап адаптации микроклональ-ных растений к ex vitro условиям, где их выживание напрямую зависит от способности преодолевать абиотический и биотический стресс. В связи с этим исследование потенциала полезных микроорганизмов для повышения стрессоустойчи-вости растений на данном этапе представляет значительный научный и практический интерес.

Цель исследования - оценка эффективности применения штамма Bacillus amyloliquefa-ciens для повышения приживаемости микрорастений мяты ( Mentha longifolia и Mentha spicata ) на этапе адаптации ex vitro в условиях контролируемой среды климатической камеры.

Задачи: разработать и оптимизировать протокол инокуляции микрорастений мяты штаммом Bacillus amyloliquefaciens S21 на этапе адаптации ex vitro ; оценить влияние бактеризации на морфометрические показатели приживаемости микрорастений (длина побега, количество листьев, сырая и сухая биомасса); исследовать влияние обработки на физиологическое состояние растений: фотосинтетическую активность (например, по индексу NDVI), содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллы a, b, каротиноиды).

Объекты и методы. Исследование проводилось на базе Федерального научного агроин-женерного центра ВИМ (ФНАЦ ВИМ). В качестве объекта исследования использовали укорененные микрорастения двух видов мят длиннолистной ( Mentha longifolia L.) и колосистой ( Mentha spicata L.).

На этапе подготовки к адаптации микрорастения извлекали из культуральных сосудов. Их корневую систему тщательно промывали дистиллированной водой и подвергали кратковременному (5 с) обеззараживанию в 0,01 %-м растворе перманганата калия (KMnO 4 ). После обработки растения высаживали в горшки объемом 0,5 л, заполненные стерильным субстратом. Субстрат представлял собой смесь нейтрализованного торфа «Агробалт-Н» и агроперлита фракции 0,1–1,0 мм в соотношении 3 : 1. Предварительную стерилизацию торфа проводили в сушильном шкафу «Экрос ПЭ-4630М» при температуре 120 °C в течение 2 ч.

Перед размещением в климатическую камеру для всех микрорастений были зафиксированы исходные биометрические параметры. Анализ морфометрических характеристик на данном этапе показал отсутствие статистически значимых различий (p > 0,05) между видами по количеству листьев: у мяты длиннолистной данный показатель составил (9,88 ± 0,31) шт., у мяты колосистой - (10,45 ± 0,45) шт. В то же время была выявлена достоверная межвидовая разница (p < 0,05) по длине побега. Растения мяты колосистой со средним значением (5,93 ± 0,18) см статистически значимо превосходили по этому показателю растения мяты длиннолистной, имевшие среднюю длину побега (5,20 ± 0,21) см. Таким образом, исходный адаптационный потенциал видов оценивался на фоне изначально различающегося развития побеговой системы.

Условия адаптации задавали в климатической камере в автоматическом режиме. Температура воздуха поддерживалась на уровне (23 ± 2) °C. Влажность воздуха была запрограммирована на линейное снижение с (96 ± 2) до (50 ± 2) % в течение 15 сут, со средней скоростью снижения 3 % в сут. Режим полива составил один раз в 48 час из расчета 25 мл воды на одно растение. Для фотосинтетически активного облучения использовали светодиодные источники света с интенсивностью фотосинтетического фотонного потока (PPFD) (140 ± 10) мкмоль • (м-2 • с-1) и спектральным соотношением длин волн (B - си- ний: G – зеленый: R – красный: FR – дальний красный) 16B:42G:39R:3FR.

В исследовании применяли штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens S21, полученный из коллекции (рег. номер в ВКПМ 05969) Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИ-ИСХМ, Санкт-Петербург). Штамм B. amylolique-faciens S21 применяли в виде готовой бактериальной суспензии, которую перед использованием разбавляли стерильной водой до конечной рабочей концентрации 1∙10⁵ КОЕ/мл. Исходная концентрация препарата составляла 2 ∙ 10⁹ КОЕ/мл. Методика приготовления рабочего раствора была адаптирована на основе ранее описанных протоколов [3, 4, 12]. Влияние микроорганизмов на рост и развитие исследуемых видов мят оценивали после однократного внесения суспензии бактерий B. amylolique-faciens в прикорневую зону методом полива.

В ходе эксперимента на этапе адаптации микрорастений проводили оценку по комплексу морфо-физиологических показателей, включая длину побегов (см), площадь (см2/растение) и количество листьев (шт.), биомассу сырую и сухую (г), содержание основных фотосинтетических пигментов (мг/г) и значение вегетационного индекса NDVI.

Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и суммы каротиноидов) определяли спектрофотометрически. Навеску свежих листьев массой 0,1 г экстрагировали 100 %-м ацетоном. Оптическую плотность полученного экстракта измеряли на двухлучевом спектрофотометре UV-2200 UV/VIS (Китай) при длинах волн 662, 644 и 440,5 нм для хлорофилла a, хлорофилла b и каротиноидов соответственно. Концентрации пигментов рассчитывали по уравнениям Лихтенталера [13]. Конечное содержание пигментов в растительной ткани, выраженное в миллиграммах на грамм сырой массы, вычисляли с учетом объема экстракта и массы навески по стандартной формуле [14]. Все измерения проводили в трех биологических повторностях.

Морфометрический анализ включал определение основных ростовых параметров. Длину побегов измеряли с использованием технической линейки с точностью до 0,1 мм. Площадь листовой поверхности и количество листьев на растение определяли с помощью фотопланиметра LI-3100 AREA METER (LI-COR, США).

Для оценки биопродуктивности определяли сырую и сухую биомассу. Сырую (надземную) биомассу фиксировали непосредственно после отбора растений для исключения потерь влаги. Массовую долю сухого вещества определяли методом высушивания навески до постоянной массы в сушильном шкафу Memmert UN-450 (Германия) при температуре 105 °С в соответствии с ГОСТ 28561-90. Взвешивание проводили на аналитических весах Ohaus EX224/AD (OHAUS, США). Сухую биомассу рассчитывали по разнице между массой навески до и после высушивания.

Статистическую обработку результатов проводили с применением дисперсионного анализа (ANOVA) в программе MS Excel. В качестве post hoc теста использовали тест Дункана. Количество анализируемых растений (n) составило десять образцов, каждый из которых был представлен тремя повторами.

Результаты и их обсуждение. Статистический анализ данных позволил оценить влияние инокуляции ризобактерией Bacillus amyloliquefa-ciens S21 на морфометрические показатели микрорастений двух видов рода Mentha в критический период адаптации к нестерильным условиям. Анализ морфометрических показателей растений мяты длиннолистной ( Mentha longi-folia ) и мяты колосистой ( Mentha spicata ) на 15-е сутки адаптации ex vitro выявил статистически достоверное (p ≤ 0,05) стимулирующее влияние инокуляции по всем изученным параметрам в сравнении с контролем. У растений мяты длиннолистной в варианте с бактериями длина побега увеличилась на 57,5 %, достигнув 13,23 против 8,40 см в контроле. Площадь листьев возросла наиболее значительно – на 209,0 % (с 121,67 до 376,00 см²/растение). Количество листьев увеличилось на 82,7 % по сравнению с контролем (необработанными растениями) (табл. 1).

Аналогичный положительный эффект был зарегистрирован и для мяты колосистой. Под действием бактеризации длина побега увеличилась на 23,9 % (с 11,30 до 14,0 см). Площадь листовой поверхности возросла на 208,4 % (с 104,83 до 323,30 см2/растение). Количество листьев увеличилось на 107,2 % по сравнению с контролем.

Таблица 1

Влияние Bacillus amyloliquefaciens S21 на морфометрические показатели мяты длиннолистой и колосистой на 15-е сутки адаптации ex vitro

The effect of Bacillus amyloliquefaciens S21 on the morphometric parameters of long-leaved and spearmint on the 15th day of ex vitro adaptation

Вид	Вариант опыта	Длина побега, см	Площадь листьев, см²/растение	Количество листьев, шт
Мята длиннолистая	Контроль	8,40 ± 0,26c	121,67 ± 4,24c	92,33 ± 3,17c
	Бактерии	13,23 ± 0,52a	376,00 ± 16,32a	168,67 ± 8,84a
Мята колосистая	Контроль	11,30 ± 0,57b	104,83 ± 3,23d	56,30 ± 2,11d
	Бактерии	14,00 ± 0,64a	323,30 ± 13,25b	116,67 ± 3,32b

Здесь и далее: разные буквы в столбцах указывают на статистически значимые различия (р ≤ 0,05)

Помимо стимуляции морфогенеза, инокуляция штаммом Bacillus amyloliquefaciens S21 достоверно увеличила биомассу у обоих изучаемых видов мяты в период адаптации ex vitro (рис. 1). У мяты длиннолистной сырая биомасса возросла в 2,7 раза, а прирост сухой массы достиг 0,86 г. У мяты колосистой эффект был выражен сильнее: сырая биомасса возросла почти в 3 раза, а количество сухого вещества – в 2,6 раза, что в абсолютных значениях соответствует приросту на 0,62 г. Результаты подтверждают высокую эффективность штамма для усиления накопления вегетативной биомассы растений в критический период адаптации ex vitro.

Рис. 1. Влияние Bacillus amyloliquefaciens S21 на сырую и сухую биомассу мяты длиннолистой и колосистой на 15-е сут адаптации ex vitro

Effect of Bacillus amyloliquefaciens S21 on wet and dry biomass of long-leaved and spearmint on day 15 of ex vitro adaptation

Исследования показали, что инокуляция штаммом Bacillus amyloliquefaciens S21 оказывала выраженное положительное влияние на морфобиологические показатели обоих видов мяты в период адаптации к условиям ex vitro. Наибольший относительный прирост наблюдался по площади листовой поверхности и накопленной биомассе, что указывает на усиление фотосинтетической активности и общей продуктивности растений. При этом мята длиннолистная демонстрировала более выраженный прирост по длине побега и сухой биомассе, тогда как у мяты колосистой наибольшее увеличение наблюдалось по количеству листьев и сырой биомассе.

Для комплексной оценки влияния бактеризации на физиологическое состояние растений был проведен анализ фотосинтетического аппарата, включая определение содержания хлорофиллов и каротиноидов (табл. 2).

У мяты длиннолистной бактеризация оказала комплексное стимулирующее действие, достоверно повысив содержание всех исследованных пигментов относительно контроля. Наибольший прирост отмечен для хлорофилла a (на 21,7 %), за которым следовало увеличение суммы хлорофиллов (a + b) на 17,6 %, каротиноидов на 12,5 % и хлорофилла b на 9,1 % по сравнению с контролем. Напротив, у мяты колосистой инокуляция привела к угнетению синтеза ключевых фотосинтетических пигментов. Наблюдалось статистически значимое снижение содержания хлорофилла a на 7,2 % и, как следствие, суммы хлорофиллов (a + b) на 6,9 %. При этом концентрация хлорофилла b и каротиноидов в варианте с бактериями достоверно не отличалась от контроля, что указывает на избирательный характер воздействия штамма.

Таблица 2

Влияние Bacillus amyloliquefaciens S21 на фотосинтетические пигменты мяты длиннолистой и колосистой на 15-е сут адаптации ex vitro

Effect of Bacillus amyloliquefaciens S21 on photosynthetic pigments of long-leaved and spearmint on day 15 of ex vitro adaptation

Вид	Вариант опыта	Содержание, мг/г сырой биомассы
		Хл. a	Хл. b	Хл. (а+b)	Каротиноиды
Мята	Контроль	0,92 ± 0,03b	0,44 ± 0,01b	1,36 ± 0,04b	0,32 ± 0,01b
длиннолистая	Бактерии	1,12 ± 0,03a	0,48 ± 0,01a	1,60 ± 0,04a	0,36 ± 0,01a
Мята колосистая	Контроль	1,66 ± 0,04a	0,65 ± 0,02a	2,31 ± 0,06a	0,50 ± 0,02a
	Бактерии	1,54 ± 0,06b	0,61 ± 0,02a	2,15 ± 0,08b	0,47 ± 0,01a

Выявленная четкая видовая (генотипическая) специфичность реакции на обработку штаммом S21 проявлялась в противоположных эффектах. Для мяты длиннолистной штамм выступал эффективным биостимулятором фотосинтетического аппарата, тогда как для мяты колосистой его применение вызывало стрессовую реакцию, вы- ражавшуюся в угнетении синтеза основных хлорофиллов.

В отличие от биохимических показателей, интегральный вегетационный индекс NDVI продемонстрировал положительную реакцию на обработку у обоих видов (рис. 2).

Рис. 2. Вегетационный индекс NDVI микрорастений мяты длиннолистной и колосистой при обработке Bacillus amyloliquefaciens S21 на 15-е сут адаптации ex vitro NDVI vegetation index of long-leaved and spearmint microplants treated with Bacillus amyloliquefaciens S21 on the 15th day of ex vitro adaptation

Под действием инокулянта значение вегетационного индекса NDVI статистически достоверно увеличилось у обоих видов, однако выраженность эффекта демонстрировала четкую генотипическую зависимость. Наибольший отклик наблюдался у мяты длиннолистной: показатель NDVI возрос на 39,0 %, достигнув значения 0,57 против 0,41 в контроле. Для мяты колосистой стимуляция была менее выраженной – прирост составил 22,7 % (до 0,54 относительно контрольных значений 0,44).

Полученные результаты согласуются с данными об эффективности бактеризации для мяты длиннолистной и мелиссы лекарственной на других этапах онтогенеза, в частности при укоренении черенков [14]. Так, исследования показали, что инокуляция бактериями рода Bacillus ( B. subtilis , штаммы 10-4 и 26D) стимулировала морфогенез и фотосинтетический аппарат этих видов, причем эффективность строго зависела от конкретного штамма и генотипа растения [14]. В настоящей работе продемонстрирована схожая закономерность: инокуляция штаммом

• B.    amyloliquefaciens S21 достоверно повышала морфометрические показатели и индекс NDVI у обоих видов мяты, однако его влияние на биохимию фотосинтетических пигментов оказалось противоположным и генотипически зависимым.

Заключение. На основании проведенных исследований установлено, что штамм Bacillus amyloliquefaciens S21 проявлял выраженный биостимулирующий потенциал в отношении микрорастений двух видов мяты в период адаптации ex vitro, однако характер его физиологического воздействия был видоспецифичным. У мяты длиннолистной (Mentha longifolia) инокуляция вызывала комплексную положительную реакцию, достоверно повышая ключевые ростовые (длина побега, количество листьев), биометрические (площадь листовой поверхности) и фотосинтетические показатели (содержание пигментов, индекс NDVI). Ключевым результатом стало значительное увеличение как сырой, так и, что наиболее важно, сухой биомассы (на 128 %). Сочетание максимальных значений индекса NDVI (0,57) и высокого прироста сухой биомассы (на 128 %) свидетельствовало об усилении продукционного процесса и повышении эффективности фотосинтетического аппарата. Данные результаты определяют мяту длиннолистную как высокоперспективную ис- ходную форму для селекции на общую продуктивность и фотосинтетическую активность с применением микробиологических технологий.

У мяты колосистой инокуляция штаммом S21 вызвала разнонаправленную реакцию: при значительном увеличении биомассы (сырой – на 195 %, сухой – на 163 %) и индекса NDVI (на 23 %) наблюдалось снижение содержания ключевых фотосинтетических пигментов (хлорофилла a и суммы хлорофиллов). Это указывает на возможное перераспределение ресурсов в пользу аккумуляции вегетативной массы, а не синтеза фотосинтетических пигментов.

Полученные результаты служат основой для разработки целевых агротехнологических приемов микробиологической биофортификации посадочного материала на этапе адаптации ex vitro. Рекомендована однократная инокуляция микрорастений штаммом Bacillus amylolique-faciens S21 в прикорневую зону на начальном этапе адаптации. Цели применения являются видоспецифичными: для мяты длиннолистной – комплексная стимуляция фотосинтетического аппарата и повышение общей продуктивности; для мяты колосистой – преимущественно направленное увеличение выхода общей биомассы, в особенности сырой массы.