Бензодиазепиновые рецепторы тромбоцитов и нейроактивные стероидные гормоны в крови человека - потенциальные мишени при алкогольной аддикции

Злоупотребление алкоголем – хроническое рецидивирующее заболевание, характеризующееся компульсивным влечением к алкоголю, формированием аддиктивного поведения и алкогольной зависимости [1]. Хроническое употребление алкоголя связано с нарушением эмоционального состояния, которое влияет на когнитивные функции через множество механизмов. Это приводит к смещению механизмов естественного подкрепления в мозге, к формированию стремления употребления алкоголя, вызывающем впоследствии глубокие негативные дефекты. Проблема лечения алкогольной аддикции представляет большие трудности в связи с возникновением рецидивов и сложностью понимания механизмов их формирования [1]. Выяснение этих механизмов является важным для превенции употребления алкоголя и развития алкогольной зависимости.

Одна из теорий развития алкоголизма предполагает сдвиг в общей возбудимости мозга как результат снижения процессов торможения. У пациентов с алкогольной зависимостью отмечают повышенную возбудимость, импульсивность, экстравагантность и другие расстройства, связанные с этими процессами. Нарушение баланса процессов возбуждения и торможения в мозге может лежать в основе высокой степени риска формирования алкогольной аддикции Усиление высокочастотной β -активности на ЭЭГ в глубоких отделах фронтальной коры мозга и, связанное с этим, нарушение сна у больных алкоголизмом, может играть значительную роль в дальнейшем прогрессировании алкоголизма и являться предиктором рецидива [7,  14]. Алкоголь облегчает активацию рецепторов

ГАМК, обладает анксиолитическими свойствами [8, 9], в связи с этой способностью его употребление является формой самолечения при возникновении тревоги и развитии тревожного состояния [12].

Исследования, проведённые на различных экспериментальных моделях животных, показали, что воздействие алкоголя приводит к снижению чувствительности к алкоголю и другим бензодиазепиновым агонистам [9; 10].

Злоупотребление алкоголем вызывает развитие толерантности и зависимости, посредством взаимодействия этанола с ГАМК_А/бензодиазепиновым рецепторным комплексом (ГАМК_А/БДР) в различных структурах головного мозга [3, 5, 12]. ГАМК А /БДР – пентамерный макромолекулярный мембранный комплекс, имеющий места специфического связывания для многих лигандов: γ – аминомас-лянной кислоты (ГАМК), барбитуратов, бензодиазепинов, алкоголя и нейростероидов [9, 10]. Предполагают, что умеренные дозы этанола действуют, непосредственно связываясь с белками, которые формируют ГАМК А /БДР, связанных с CL^- – ионным каналом, функция которого аллостерически модулируется в различных областях мозга, участвующих в развитии эффектов этанола [8].

Этанол проявляет фармакологический профиль подобный ГАМК, который сходен с фармакологической активностью и поведенческим проявлением эффектов пре-гнан-нейростероидов [10, 16]. Показано, что в период отмены этанола у крыс повышалась чувствительность к противосудорожному действию 3 α -восстановленных пре-гнанстероидов [6]. Нейроактивные стероиды вовлечены в физиологические и патофизиологические процессы, в частности, в развитие депрессии, эпилепсии, тревожных состояний, панических атак, алкогольной реакции и алкоголизма [11].

Повышение возбудимости при синдроме отмены модуляторов ГАМК А Р, таких как бензодиазепины и алкоголь, связано с быстрыми колебаниями уровней эндогенных нейростероидов. Снижение ГАМКергической трансмиссии (как рецепторного связывания, так и абсолютного уровня ГАМК) может лежать в основе нарушения процессов торможения и приводить к гипервозбудимости, характерной для больных эпилепсией, алкоголизмом и лиц с высоким риском развития алкогольной зависимости.

Одной из ведущих проблем в лечении алкоголизма является необходимость формирования новых подходов к профилактике и лечению этого заболевания, поиск эффективных фармакологических средств коррекции, действующих на молекулярные мишени влияния алкоголя в ЦНС, способных препятствовать развитию алкогольной интоксикации и зависимости. В связи с этим представляется актуальным изучение бензодиазепиновой рецепторной системы и уровней нейроактивных стероидных гормонов у больных алкоголизмом, что может способствовать дальнейшему выяснению этиопатогенеза этого заболевания и поиску новых перспективных препаратов, необходимых для фармакотерапевтической коррекции.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении свойств БДР плазматических мембран тромбоцитов и уровней нейроактивных стероидных гормонов у больных алкоголизмом.

Материал и методы. Исследование проводилось в лаборатории нейробиологии НИИ психического здоровья СО РАМН и лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН. Обследовали 36 пациентов - мужчин в возрасте от 23 до 52 лет, страдавших алкоголизмом (по МКБ-10 рубрики F10.201, F10.202). Все они в период обследования находились на лечении в клинике НИИ психического здоровья СО РАМН. Контрольную группу составили 19 психически и соматически здоровых лиц того же пола и возраста. Все обследованные были информированы о проведении исследований и дали на него письменное согласие. Кроме того, исследование одобрено этическим комитетом НИИ психического здоровья СО РАМН. Тромбоциты пациентов и здоровых доноров были получены из венозной кро- ви. Их выделяли в соответствии с рекомендациями А.И. Киктенко и соавт. [2]. После перемешивания 30 мл крови с 5 мл антикоагулянта (2,5% цитрата натрия, 1,37% лимонной кислоты и 2% глюкозы рН 5,7) плазма, обогащенная тромбоцитами, была получена низкоскоростным центрифугированием 200 g в течение 20 мин при 23°С. Тромбоциты осаждали из этой плазмы центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин при 23°С, отмывали трижды трис-НСl-буфером (50 мМ, РН 7,4), замораживали и хранили при 70°С. до связывания с [3H]-PK11195. Связывание осуществляли следующим образом. Аликвоты мембранной суспензии, содержащей 50 мг белка, по определению колориметрическим методом Лоури инкубировали с [3H]-PK11195 (специфическая активность 120 Ки/ммоль) в диапазоне концентраций 0,5-50 нМ в отсутствие (общее связывание) и в присутствии (неспецифическое связывание) немеченого 1 мM РК11195 в 0,25 мл конечного объема инкубационной пробы. После инкубации в течение 90 мин при 0-0,5°С образцы фильтровали через GF/B фильтры («Whatman», Англия), используя систему вакуумной фильтрации НАR-VESTER-SKATRON (США), фильтры промывали не менее чем в 15 мл холодного буфера трис-НС1 (50 мМ, рН 7,4). Радиоактивность определяли, помещая высушенные фильтры в 8 мл сцинтилляционного коктейля ЖС-8, используя жидкостный сцинтилляционный счетчик RACR-BETA 1215 (LКВ). Максимальную плотность (Bмакс) мест специфического связывания БДР «периферического типа» определяли с применением анализа Скэтчарда кривых насыщения. Параметры связывания оценивали для каждого случая индивидуально.

Для определения уровней стероидных гормонов прогестерона, кортизола и тестостерона были использованы соответствующие наборы гормонов для иммунноферментного анализа. В данной работе использовались наборы фирмы Био-Рад. Статистичская достоверность изменений изученных показателей осуществлялись посредством пакета программ «STATISTICA for Windows» v. 8.0.

Результаты и обсуждение. Изучение бензодиазепиновых рецепторов периферического типа тромбоцитов крови пациентов при алкоголизме.

Нами были проведены исследования свойств БДР тромбоцитов крови у больных алкоголизмом. Тромбоциты использовались нами в качестве экстрацеребральной модели для изучения свойств БДР у больных в состоянии алкогольной абстиненции. Исследования характеристик связывания [³H]PK11195 с БДР «периферического типа» тромбоцитов, полученных от больных алкоголизмом, выявили повышение плотности рецепторов: (В_макс.: 4733* ± 379 фмоль/мг белка, Р<0.05) по отношению к контрольной группе (В_макс.: 3358 ± 242 фмоль/мг белка). Значимых различий аффинности рецепторов выявлено не было.

Полученные ранее нами данные свидетельствуют о влиянии алкоголя на свойства БДР “центрального” и “периферического” типов головного мозга (исследования аутопсийного материала) человека [3, 15] и крысы [4], что согласуется с изменениями свойств БДР «периферического типа» тромбоцитов больных алкоголизмом. Причём это влияние носит однонаправленный характер, отражающий адаптивные изменения БДР. Полученные результаты подтверждают специфичную роль БДР в обеспечении фармакологии ГАМКА/БД-рецепторного комплекса, его функции и проявлении поведенческих эффектов, в том числе поведения, связанного с влиянием алкоголя Уровень плотности БДР «периферического типа» – наиболее чувствительный индекс повреждения нервной ткани, в особенности глиальных клеток. Пролиферация глии, сопро- вождающая нейрональные дегенеративные процессы, может быть связана с повышением плотности этих рецепторов.

Поскольку БДР «периферического типа» является митохондриальным белком, экспрессируемым на высоком уровне в тканях, синтезирующих стероидные гормоны, включая глиальные клетки мозга и связывают холестерол с высокой аффинностью, являясь ключевым элементом в механизме импорта холестерола в митохондрии к первому стероидогенному энзиму, инициируя и поддерживая биосинтез нейростероидов. Образование “нейростероидов” (НС) и их метаболитов (промежуточных продуктов) является критичными компонентами нормальной функции мозга [11, 13].

Изучение уровней стероидных гормонов в плазме крови у больных алкоголизмом.

При проведении сравнительного изучения уровней стероидных гормонов у больных алкоголизмом и добровольцев из группы контроля было установлено, что содержание прогестерона (ПГ) и тестостерона (ТС) в крови было достоверно ниже у пациентов по сравнению с концентрацией этих гормонов в контрольной группе (табл. 1). ПГ является предшественником в цепи биосинтеза прегнан – нейростероидов, включая ТС. Сниженный уровень ПГ ведёт к снижению его производных, включая ТС. Исследование уровней кортизола выявило повышенный уровень у больных алкоголизмом, по сравнению с контрольной группой. Повышенное содержание кортизола характерно для состояний дистресса и депрессивных расстройств, связанных с дефицитом ГАМК.

Роль гиперактивности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси при психических расстройствах подтверждается тем, что у животных при стрессе и сходных с депрессией состояниях в крови значительно повышено содержание КРФ, АКТГ и кортикостероидов. Важным фактором является и дефицит ГАМК. Показано, что от цитотоксического действия глюкокортикоидов и глутамата в первую очередь страдают именно ГАМКергические тормозные интернейроны. Предполагаемая общность патогенетических механизмов эпилептических пароксизмов и очагов биоэлектрической активности в гипоталамусе, обусловливающих компульсивное влечения к алкоголю. При аффективных расстройствах и при алкоголизме происходит нарушение механизма отрицательной обратной связи, по которому выделяющийся из надпочечников кортизол тормозит продукцию КРФ, в результате чего содержание КРФ, АКТГ и кортизола аномально увеличивается.

Таблица 1

Уровни стероидных гормонов в сыворотке крови больных алкоголизмом и здоровых добровольцев, нмоль/л

Примечание: *Уровень значимых различий P <0.05

Выявленное снижение уровня ПГ в крови у больных алкоголизмом может свидетельствовать о снижении ПГ – основного предшественника нейростероидов в ткани головного мозга. Нами показано (см. выше), что хроническое воздействие алкоголя вызывает изменение свойств

БДР тромбоцитов у больных алкоголизмом, компенсаторно повышает плотность этих рецепторов в условиях снижения ГАМКергической функции. У больных алкоголизмом мы выявили повышение плотности БДР тромбоцитов, что может отражать изменение БДР в ЦНС. Поскольку БДР «периферического типа» являются ключевым звеном на этапе синтеза стероидов, компенсаторное их повышение может свидетельствовать об усилении стероидогенной функции БДР в периферических тканях и ЦНС. Выявленное снижение уровня ПГ и ТС может свидетельствовать об усилении метаболизма данных стероидов и образовании основного его метаболита – аллопрегнаноло-на, обладающего анксиолитическим действием на ГАМ-К А /БДР, что может являться компенсаторным механизмом в условиях дефицита ГАМК-функции. Повышение метаболизма ПГ приводит к снижению его уровня, возникновению дефицита как самого ПГ, так и его метаболитов (аллопрегнанолона и прегнанолона), что также может вносить дополнительный вклад в формирование тревожных, пароксизмальных и компульсивных расстройств, повышению судорожной готовности, выраженной вегетативной симптоматики, связанной с дефицитарным состоянием ГАМКергической нейротрансмиссии. Нарушенный гомеостаз НС может быть фактором риска для развития психических заболеваний, в частности, депрессии, эпилепсии, алкогольной зависимости, и, наоборот, психофармакологические препараты, модулирующие активность НС, могут оказывать клинические эффекты посредством их влияния на равновесие НС [11]. Разработка новых фармакологических препаратов, влияющих на метаболизм эндогенных НС с учётом индивидуальных особенностей, связанных с высоким риском развития алкогольной зависимости, является одной из значимых стратегий в лечении психических расстройств и алкоголизма.

Полученные нами результаты исследований возможно использовать в системе поиска и отбора новых перспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма и определение характеристик радиорецепторного связывания - в качестве одного из показателей тестирования при отборе новых химических соединений антиалкогольного профиля. БДР «периферического типа» тромбоцитов крови больных алкоголизмом и уровней НС в сыворотке крови пациентов использовать в качестве экстраце-ребральной тестирующей системы оценки токсического влияния алкоголя и эффективности действия фармакологических препаратов, используемых для лечения и профилактики алкоголизма.