Биодеградация линейных полиакриламидов амидазосодержащими бактериями

Полиакриламиды (ПАА) представляют собой группу полимеров с высокой молекулярной массой на основе акриламида и его производных. ПАА широко применяются в различных областях промышленности и деятельности человека: водоочистке, нефтеперерабатывающей, целлюлозно-бумажной, косметической, лакокрасочной и пищевой отраслях, сельском хозяйстве, добыче полезных ископаемых [Jiang et al., 2019; Uranta et al., 2019; Gaytán, Burelo, Loza-Tavera, 2021]. В большинстве случаев эти полимеры используют в качестве флокулянтов, которые способствуют эффективному разделению твердой и жидкой фаз в воде, содержащей взвешенные вещества [Wei et al., 2018; Akbar, Khan, Abid, 2022].

ПАА и его производные могут иметь различную молекулярную массу и плотность заряда при изменении параметров реакции полимеризации и/или относительных количеств используемых реагентов. Высокомолекулярные водорастворимые полимеры могут быть модифицированы для придания им неионогенных, анионных или катионных свойств для конкретных целей [Guezennec et al., 2015].

ПАА обычно считается нетоксичным веществом для растений и животных, однако присутствие мономеров в его составе или их высвобождение при деградации полимера могут являться причиной загрязнения окружающей среды, а также нанести вред здоровью человека и животных. В отличие от ПАА, акриламид представляет собой сравнительно небольшую молекулу, поэтому может легко проходить через биологические мембраны [Bedade, Singhal, 2018; Nyyssölä, Ahlgren, 2019].

Таким образом, необходимо всесторонне изучать проблему эффективной утилизации этих полимеров. Разрушение ПАА и его производных может происходить путем механических, фотолитических, химических и биологических процессов [Gilbert et al., 2017]. Биодеградация является экономически эффективным и экологичным методом очистки окружающей среды от ксенобиотиков и органических поллютантов [Caulfield et al., 2003; Guezennec et al., 2015; Nyyssölä, Ahlgren, 2019].

Для большинства микроорганизмов мономер ПАА является токсичным и может оказывать влияние на их рост и сульфгидрильные белки клеток. Тем не менее, многие штаммы способны расти в присутствии акриламида и частично или полностью разлагать его с помощью амидаз. Амидазы – широко распространенные в живой природе универсальные ферменты. Продукция амидаз обнаружена как у представителей бактерий родов Arthrobacter , Agrobacterium , Alcaligenes , Acinetobacter , Brevibacterium , Bacillus , Burkholderia , Delftia , Enterobacter , Enterococcus , Escherichia , Helicobacter , Microbacterium , Moraxella , Nocardia , Klebsiella , Pseudomonas , Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Stenotrophomonas , так и среди грибов родов Aspergillus , Candida , Kluyvera , Kluyveromyces [Duda-Chodak et al., 2016; Joshi, Abed, 2017].

Полимеры с высокой молекулярной массой, такие как ПАА, не могут проходить через биологические мембраны, поэтому для их биодеградации требуется действие внеклеточных амидаз либо в аэробных, либо в анаэробных условиях, и далее они частично или полностью разлагаются множеством различных ферментов [Caulfield et al., 2003; Guezennec et al., 2015; Gaytán, Burelo, Loza-Tavera, 2021]. Только некоторые виды, принадлежащие к бактериальным родам Enterobacter sp., Azomonas sp., Bacillus sp., Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. и Clostridium sp., способны использовать ПАА и его производные в качестве источника углерода и/или азота. Хотя амидазы участвуют в микробиологическом разложении ПАА, сведения о метаболических путях и ферментах, катализирующих деградацию углеродной основы полимера, в настоящее время не ясны [Duda-Chodak et al., 2016; Joshi, Abed, 2017; Максимова, Горшкова, Демаков, 2017].

Целью настоящей работы явилось изучение роста штаммов, обладающих амидазной активностью, на линейных катионных, анионных и неионогенных ПАА как источниках углерода и/или азота, и изменения вязкости этих полимеров.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы, условия культивирования и подготовка биомассы

Штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis ИЛ БИО, выделенный ранее из почвы в присутствии поперечно-сшитого ПАА и поддерживаемый в лаборатории молекулярной биотехнологии «ИЭГМ УрО РАН» – филиала ПФИЦ УрО РАН [Максимова и др., 2022], и Alcaligenes faecalis 2, выделенный из активного ила очистных сооружений г. Перми с 3-цианопиридином как единственным источником углерода и азота [Демаков и др., 2015], культивировали в минимальной солевой среде следующего состава (г/л): КН 2 РО 4 – 1.0; K 2 HPO 4 ×3H 2 O – 3.7; NaCl – 0.5; MgSO 4 ×7H 2 O – 0.5; FeSO 4 ×7H 2 O – 0.005; CoCl 2 ×6H 2 O – 0.01, рН 7.2 ± 0.2. В качестве источника углерода для родококка служила глюкоза в концентрации 0.1%, а источником азота – ацетонитрил в концентрации 0.05%. Для штамма алкалигенеса единственным источником углерода и азота был 0.1 М ацетамид.

Культивирование проводили в конических колбах объемом 1 000 мл в 400 мл минеральной среды в течение 7 сут. на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 120 об/мин при температуре 30°С.

Биомассу концентрировали центрифугированием в течение 20 мин. при 5 000 g на центрифуге 5804 R («Eppendorf», Германия), отмывали однократно от среды культивирования стерильным хлоридом натрия в концентрации 0.9%, центрифугировали повторно, разводили в стерильном растворе хлорида натрия.

Способность бактерий использовать ПАА в качестве источника углеродного, азотного питания или единственного ростового субстрата изучали в жидкой минимальной солевой среде. В качестве субстратов роста использовали линейные ПАА в концентрации 0.1%, 0.05% и 0.01%: ПАА Праестол 650 BC, обладающий катионной активностью, ПАА Праестол 2540, обладающий анионной активностью, ПАА Праестол 2300 D, обладающий неионогенной активностью (получены из Института технической химии УрО РАН, Пермь). Клетки бактерий выращивали в среде с ПАА в трех вариантах: 1) в качестве единственного источника углерода и азота; 2) без дополнительного источника азота с глюкозой в концентрации 0.1% как источником углерода для R. erythropolis ИЛ БИО и ацетатом натрия в концентрации 1% для A. faecalis 2; 3) без дополнительного источника углерода с хлористым аммонием в концентрации 10 мМ как источником азота. Культивирование проводили в конических колбах объемом 100 мл в 30 мл среды в течение 10–14 сут. на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 110 об/мин при температуре 30°С. Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности клеточной суспензии, измеренной при длине волны 540 нм (ОП 540 ) на фотоэлектроколориметре КФК-3 (АООТ «ЗОМЗ», Россия) в 0.5 см кюветах. Динамический коэффициент вязкости среды измеряли в течение 2 мин. при 100 rpm на ротационном вискозиметре ROTAVISC lo-vi Complete («IKA», Германия).

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов выполнена с помощью пакета программ Microsoft Excel 2019. Результаты представлены как среднее значение не менее чем трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего (M±m, n=3).

Результаты и их обсуждение

Результаты культивирования бактерий R. erythropolis ИЛ БИО и A. faecalis 2 в среде с линейными ПАА представлены в таблице. Выявлено, что R. erythropolis ИЛ БИО и A. faecalis 2 могут использовать ПАА катионный 650 BC, анионный 2540 и неионогенный 2300 D марок Праестол в концентрации 0.1, 0.05 и 0.01% в качестве источника азота для роста биомассы. При этом наибольший рост бактерий наблюдали в среде с неионогенным полимером в концентрации 0.1%: ОП 540 в конце культивирования достигала 0.140 и 0.300 соответственно. В результате этого для R. erythropolis ИЛ БИО выявлено снижение динамического коэффициента вязкости среды с катионным и неионогенным в концентрации 0.05 и 0.01%, а также анионным в концентрации 0.1, 0.05 и 0.01% в качестве источника азота с дополнительным источником углерода – глюкозой. Для A. faecalis 2 – 650 BC и 2300 D в концентрации 0.1 и 0.05%, а также 2540 в концентрации 0.1, 0.05 и 0.01% с дополнительным внесением ацетата натрия. Следует отметить, что не во всех случаях рост амидазосодержащих бактерий коррелировал со снижением вязкости полимера. Возможно, это связано с отщеплением аминогрупп, не затрагивающим углеродный остов молекулы. Однако в естественных условиях на полимер воздействует комплекс физико-химических факторов (ультрафиолетовое излучение, изменения рН среды и сезонные колебания температур), что вместе с биохимической деятельностью микроорганизмов может привести к деструкции полимера.

Рост бактерий R. erythropolis ИЛ БИО и A. faecalis 2 в среде с линейными ПАА

[Growth of R. erythropolis IL BIO and A. faecalis 2 bacteria on a medium with linear PAA]

ПАА	Дополнительный источник С или N	В начале культивирования	В конце культивирования
		Динамический коэффициент вязкости, мПа•с	ОП 540	Динамический коэффициент вязкости, мПа•с
Rhodococcus erythropolis ИЛ БИО
Катионный, 0.1%	N	6.5	Слабый рост, хлопья	6.9
Катионный, 0.1%	C	6.4	0.125	6.97
Катионный, 0.1%	–	6.84	Слабый рост, хлопья	7.02
Катионный, 0.05%	N	5.7	Слабый рост, хлопья	5.65
Катионный, 0.05%	C	5.6	0.110	5.38
Катионный, 0.05%	–	5.48	Слабый рост, хлопья	5.46
Катионный, 0.01%	N	3.8	Слабый рост, хлопья	4.02
Катионный, 0.01%	C	4.02	0.070	3.96
Катионный, 0.01%	–	3.9	Слабый рост, хлопья	3.9

Окончание таблицы

ПАА	Дополнительный источник С или N	В начале культивирования	В конце культивирования
		Динамический коэффициент вязкости, мПа•с	ОП 540	Динамический коэффициент вязкости, мПа•с
Анионный, 0.1%	N	18.6	Слабый рост, хлопья	18.0
Анионный, 0.1%	C	18.5	0.100	18.1
Анионный, 0.1%	–	22.0	Слабый рост, хлопья	18.9
Анионный, 0.05%	N	7.68	Слабый рост, хлопья	7.32
Анионный, 0.05%	C	7.4	0.030	6.9
Анионный, 0.05%	–	7.7	0.010	7.63
Анионный, 0.01%	N	4.3	Слабый рост, хлопья	4.37
Анионный, 0.01%	C	4.5	0.015	4.42
Анионный, 0.01%	–	4.62	Слабый рост, хлопья	4.53
Неионогенный, 0.1%	N	5.7	Слабый рост, хлопья	5.93
Неионогенный, 0.1%	C	5.64	0.140	5.77
Неионогенный, 0.1%	–	5.6	Слабый рост, хлопья	5.89
Неионогенный, 0.05%	N	4.74	Слабый рост, хлопья	4.64
Неионогенный, 0.05%	C	4.8	0.092	4.5
Неионогенный, 0.05%	–	4.86	0.010	4.7
Неионогенный, 0.01%	N	3.84	Слабый рост	3.85
Неионогенный, 0.01%	C	3.78	0.040	3.66
Неионогенный, 0.01%	–	3.8	Слабый рост	3.85

Alcaligenes faecalis 2

Катионный, 0.1%	N	6.42	Слабый рост, хлопья	6.44
Катионный, 0.1%	C	6.36	0.140	5.94
Катионный, 0.1%	–	6.72	Слабый рост, хлопья	6.7
Катионный, 0.05%	N	5.2	Слабый рост, хлопья	4.95
Катионный, 0.05%	C	5.1	0.060	4.7
Катионный, 0.05%	–	5.15	Слабый рост, хлопья	4.8
Катионный, 0.01%	N	3.63	Слабый рост, хлопья	3.5
Катионный, 0.01%	C	3.85	Слабый рост, хлопья	3.75
Катионный, 0,01%	–	3.9	Слабый рост, хлопья	3.52
Анионный, 0.1%	N	18.7	Слабый рост	19.4
Анионный, 0.1%	C	18.5	0.085	18.3
Анионный, 0.1%	–	22.0	0	21.0
Анионный, 0.05%	N	7.68	0.011	7.48
Анионный, 0.05%	C	7.4	0.060	6.36
Анионный, 0.05%	–	7.62	0.025	6.74
Анионный, 0.01%	N	4.3	0	4.33
Анионный, 0.01%	C	4.44	Слабый рост	4.2
Анионный, 0.01%	–	4.6	Слабый рост	4.4
Неионогенный, 0.1%	N	5.6	Слабый рост, хлопья	5.63
Неионогенный, 0.1%	C	5.4	0.300	4.73
Неионогенный, 0.1%	–	5.6	Слабый рост, хлопья	5.9
Неионогенный, 0.05%	N	4.8	Слабый рост, хлопья	4.9
Неионогенный, 0.05%	C	4.6	0.100	4.25
Неионогенный, 0.05%	–	4.86	Слабый рост, хлопья	4.9
Неионогенный, 0.01%	N	3.84	Слабый рост, хлопья	3.8
Неионогенный, 0.01%	C	3.72	0.025	3.8
Неионогенный, 0.01%	–	3.8	Слабый рост, хлопья	3.9

Отмечался слабый рост бактерий и образование небольших хлопьев в среде с данными полимерами как источниками углерода с введением в среду дополнительных источников азота, а также как единственными источниками углерода и азота.

Отсутствие роста A. faecalis 2 наблюдали в среде с анионным полимером в концентрации 0.1% в качестве единственного ростового субстрата и в концентрации 0.01% в качестве углеродного питания.

Таким образом, нами было показано, что неионогенный и катионный ПАА подвержены более эффективной микробной деградации, чем анионный. По-видимому, это связано с отсутствием электростатического отталкивания между отрицательно заряженной клеточной стенкой и молекулой полимера.

Заключение

В связи с широким применением акриловых полимеров в качестве флокулянтов для очистки сточных вод поиск микроорганизмов, которые могли бы частично или полностью разлагать ПАА и его производные, является непростой задачей из-за особенностей строения полимеров, а также возможной токсичности акриламида в их составе.

Изученные нами бактериальные штаммы R. erythropolis ИЛ БИО и A. faecalis 2, обладающие амидазной активностью, могут деградировать данные ПАА, используя их в качестве субстрата для роста, например, в качестве источника азота с дополнительным источником углерода. При этом эффективность микробной деградации ПАА зависит от его заряда. В перспективе данные штаммы могут быть применены для утилизации избытков отработанного полимера.