Биохимическая характеристика культур, выделенных из содового озера Нухэ-Нур (Баргузинская котловина, Республика Бурятия)

Баргузинская котловина расположена между Баргузинским и Икатским хребтами у северо-восточного побережья Байкала в Республике Бурятия. В Баргу-зинской котловине расположены различные группы озер, различающиеся по происхождению и морфологии, гидрохимическому и гидрологическому режимам [Таксономическое разнообразие... 2021]. Содовые озера представляют собой экстремальные экосистемы, в которых алкалофильное микробное сообщество является основной живой компонентой в этих озерах.

Озеро Нухэ-Нур (53°38′781 ” с. ш. 109°56′807 ” в. д., высота 479 м над ур. м.) площадью около 2–2,5 км² располагается в надпойменном понижении на степном участке долины по правому берегу реки Баргузин.

Изучение пептидаз бактерий, выделенных из экстремальных мест обитания, предоставляет уникальную возможность исследовать стратегии функционирования прокариотной клетки. Предполагается, что усиленный синтез гидролитических ферментов является одним из способов адаптации бактерий к экстремальным условиям местообитания [Ward, 1985]. В настоящее время микроорганизмы представляют собой наиболее перспективный источник получения пептидаз за счет их высокого биохимического разнообразия и относительно высокой стабильности и активности [Lei et al., 2017; Аминопептидазная активность... 2018]. Протеолитические ферменты микробного происхождения широко используются в промышленности и являются многоцелевыми ферментами.

Целью нашей работы являлось выделение алкалогалофильных бактерий из содового озера Нухэ-Нур и изучение их биохимической характеристики, а именно внеклеточной протеолитической активности.

Материал и методика

Пробы донных осадков для микробиологического анализа были отобраны в июле 2022 г. До проведения анализов пробы, отобранные в стерильную тару, хранили в холодильнике при -20 °С.

В местах отбора проб температуру измеряли сенсорным электротермометром Long E905050 (Prima, Португалия), рН определяли потенциометрически, при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия). Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4 (HM Digital, Cин-гапур) [Органотрофные бактерии... 2016].

Культуры NN22s и NN22n выделены из донных осадков содового озера Нухэ-Нур, расположенного в Курумканском районе Республики Бурятия. Штаммы бактерий были выделены на среде состава (г/л): NH4Cl — 0,4; KH2PO4 — 0,5; NaNO3 — 0,4; MgCl2 — 0,2; Na2SO4 — 0,5; NaCl — 0,5; дрожжевой экстракт — 1. В качестве источника азота использовали триптон в конечной концентрации 1,5 %. Оптимальные значения рН роста бактерий устанавливали карбонат-бикарбонат-ным буфером до рН 9,0–9,5 [Раднагуруева и др., 2011]. Культуры инкубировались при 30 °С.

Для определения биохимических характеристик культур использовали культуральную жидкость (КЖ) штаммов NN22s и NN22n. КЖ штаммов отбирали каждые 24 часа в течение 6 суток. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (12 000 об/мин, 15 мин), полученный супернатант использовали для определения активности пептидаз.

Определение внеклеточной протеолитической активности в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера [Erlanger et al., 1961], используя 5 мМn-нитроанилидные субстраты пептидаз-трипсиноподобных, субтилизи-ноподобных, химотрипсинподобных, цистеиновыхи аминопептидаз (BAPA, GlpAALpNA, GlpFpNA, GlpFApNA и FpNA, LpNA соответственно) [Раднагуру-ева и др., 2011]. Измерение активности пептидаз проводили по ранее описанной методике [Аминопептидазная активность... 2018].

Результаты и обсуждение

Из накопительных культур донных осадков озера Нухэ-Нур (рН 9,6; М=9,8 г/дм3) (северное и южное соответственно) были выделены аэробные культуры NN22n и NN22s с устойчивым ростом на агаризованной среде Пфеннига с триптоном (рН 9). На плотной среде штамм NN22n образует круглые глянцевые, блестящие колонии кремового цвета, пигментирующие в среду, штамм NN22s образует крупные белые колонии диаметром 10–15 мм, матовые с неровными краями.

По результатам анализа гена 16S рРНК чистых культур бактерий было получено около 500 последовательностей гена, кодирующего 16S рРНК, что недостаточно для точной идентификации штаммов. По предварительному анализу последовательности гена 16S рРНК по результатам BLAST-анализа мы можем предположить, что наиболее близкими к исследованному штамму NN22 n могут быть виды: Alkali-monas callagenimarina , Alkalimonas delamerensis , Alkalimonas amylolytica . Уровень сходства с гомологами составил 99,32 %. Ближайшими гомологами штамма NN22s были виды Paenibacillus mobilis , Paenibacillus amylolyticus , Paenibacillus pabuli . Уровень сходства со всеми — 99,31 %. Для более точной идентификации штаммов будет определена полная последовательность гена, кодирующего 16S рРНК.

На основании определения оптимальных параметров и границ роста по отношению к NaCl штаммы отнесены к умеренным галлофилам. Культуры NN22s и NN22n способны расти в широком диапазоне концентраций NaCl от 10 до 50 г/л с оптимумом 20–30 г/л (табл. 1). Температурный диапазон роста культур достаточно широкий и составил 20–40 °С с оптимумом при 30 °С.

Таблица 1

№	Штамм	Ближайшие гомологи ( % сходства)	NaClопт, г/дм3	Т опт , ºС
1	NN22n	Alkalimonas callagenimarina (99,32 %) Alkalimonas delamerensis (99,32 %) Alkalimonas amylolytica (99,32 %)	30	30
2	NN22s	Paenibacillus mobilis (99,66 %) Paenibacillus amylolyticus (99,31 %) Paenibacillus pabuli (99,31 %)	20–50	30

Наиболее важными характеризующими свойствами фермента, синтезируемыми бактериями, является его строение субстратсвязывающего участка молекулы и строение каталитического участка. Этими свойствами обусловливается способность расщеплять субстраты известного состава. Поэтому нами были проведены исследования по определению субстратной специфичности.

Нами проведено сравнительное изучение секреции внеклеточных пептидаз в зависимости от минерализации и времени культивирования (до 6 суток культивирования). Показано, что культура NN22n активно продуцирует ферменты в широком диапазоне концентрации NaCl 0–50 г/л с максимальной секрецией на 5-е сутки культивирования (рис. 1). По остальным субстратам — похожая картина.

Изученная культура NN22n показала высокие активности в отношении всех субстратов (рис. 2). Максимум активности по субстрату ВАРА, GlpAALpNa отмечен на 5-е сутки культивирования и составила 0,85 и 0,49 ед. соответственно. По субстрату для химотрипсинподобных пептидаз GlpFpNA максимум секреции показан на 6-е сутки культивирования — 0,66 ед.

Рис. 1. Внеклеточная пептидазная активностькультуры NN22n по субстрату BAPA в зависимости от концентрации NaClи времени культивирования

Рис. 2. Внеклеточная пептидазная активность культуры NN22n по различным субстратам

Штамм NN22s не гидролизует субстраты для эндопептидаз, но гидролизует субстраты для экзопетидаз. Показано, что культуры NN22n и NN22s гидролизуют субстрат для аминопептидаз — LeupNa (рис. 3). Максимум активности по этому субстрату определены на 3–4-е сутки культивирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что пептидазы штаммов расщепляют связи, образованные гидрофобной аминокислотой — лейцин.

Рис. 3. Субстратная специфичность на n-нитроанилидном субстрате LeupNA у штаммов NN22n и NN22s в зависимости от времени культивирования

Таким образом, результаты показали границы адаптации и функционирования выделенных бактерий в экстремальных условиях содового озера Нухэ-Нур. Анализ внеклеточной пептидазной активности культур NN22n и NN22s на различных п-нитроанилидных субстратах показал различную субстратную специфичность. Культура NN22n продуцирует как эндопептидазы, так и экзопептидазы, тогда как культура NN22s — только экзопептидазы, что свидетельствует об особенности конкретного вида бактерии и его способности гидролизовать один и тот же белковый субстрат различными ферментативными механизмами. Способность ферментов к расщеплению белков в условиях повышенной минерализации и в щелочных условиях играет важную роль для их жизнедеятельности в экстремальных местах обитания.