Биологически активные вещества белковой природы с антифунгальным и ростстимулирующим эффектами, выделенные из чеснока посевного (Allium sativum L.)

Среди средств защиты растений от грибных болезней преобладающими остаются химические. Они эффективны, но имеют ряд недостатков, к которым относится нарушение биологического равновесия, накопление остаточных количеств химикатов в сельскохозяйственной продукции, прогрессирующая устойчивость к ним у патогенных организмов, высокая стоимость фунгицидов и катастрофическое загрязнение окружающей среды (13, 14). Несмотря на появление на рынке новых химических фунгицидов, общая ситуация по проблеме защиты растений от болезней и увеличения 705

урожайности принципиально не меняется. Распространение таких опасных инфекций, как корневые гнили, мучнистая и ложномучнистая роса огурца, фузариозы и ржавчина зерновых культур, фитофтороз картофеля, бактериозы овощных и плодовых культур часто имеет эпифитотийный характер и приводит к чрезвычайно высоким потерям урожая и снижению его качества. В последние годы возрастает интерес к препаратам на основе микроорганизмов-антагонистов, повышающих устойчивость к стрессорам, а также к белкам и низкомолекулярным соединениям, проявляющим биологическую активность. Считается, что эти средства лучше вписываются в интегрированные системы защиты растений: они эффективны, селективны и сравнительно безопасны для природы и человека (15, 16).

На сегодняшний день спектр препаратов, способных ингибировать развитие болезней у растений, сохраняя или повышая урожайность, достаточно широк. Однако б о льшая их часть представлена синтетическими соединениями. К ним относятся производные тетрагидрофурана, тиазолил-5-карбонамида, композиция 2-(5-фенил-3,6-диаза-2,7-диоксаокта-3,5-дифе-нил)фенилакриламида и анилинопиримидина (17-19).

Фермент аллиназа, выявленный у чеснока, катализирует образование аллицина — биологически активного соединения, ответственного за характерный чесночный запах. Аллиназа, содержащая 5,5-6,0 % остатков нейтральных сахаров, может формировать комплекс с маннозоспецифичным лектином чеснока (ASA — A . sativum allinase). Однако пока что изучен только способ образования и условия существования этого комплекса (20, 21). Данные об его действии на живые системы отсутствуют.

Мы впервые показали наличие биологической активности (подавление развития пирикуляриоза и гельминтоспориоза у зерновых культур, стимулирование прорастания семян и развития проростков чеснока) у лектин-аллиназного комплекса, а также у выделенного нами пептида с молекулярной массой 4392 Да, которые содержатся в чесноке.

Цель работы — выделение веществ пептидной природы из чеснока посевного и оценка их антифунгального и ростстимулирующего эффекта.

Методика . Очищенные луковицы (3 кг) чеснока посевного ( Allium sativum L.) сорта Подмосковный измельчали на фрагменты размером 1½1 см, заливали 10 л водно-солевого раствора (2,06^10 — 2 М NH 4 NO 3 , 1,88x10 — 2 М KNO 3 , 3,0x10 — 3 М CaCl₂, 1,5x10 — 3 М MgSO 4 , 1,25 x10 ^{- 3} М KH 2 PO 4 ) и выдерживали в холодильнике 4-5 ч при 4 °С. К полученному таким образом экстракту после центрифугирования (3000 g, 30 мин) при постоянном перемешивании добавляли кристаллический сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л) для осаждения (высаливания) белков (22). Смесь инкубировали в течение 20 сут при 4 °С. После 30-минутного центрифугирования при 10000 g для удаления солей осадок диализовали при 4 °С против 0,05 М фосфатного буфера (соотношение объемов диализуемой фракции и буфера — 1:50), супернатант — против воды.

Обессоленный белковый осадок растворяли в минимальном объеме 0,05 М фосфатного буфера и фракционировали с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии на колонке Bio-Sil TSK-125 300 ½7,5 мм («Bio-Rad Laboratories», США) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 («Agilent Technologies», США). Элюцию осуществляли 0,05 М фосфатным буфером со скоростью 0,5 мл/мин в течение 12 мин. Детекцию проводили при X = 280 нм. Собирали фракцию, выходящую с колонки первой, поскольку именно она содержала наиболее высокомолекулярные белки. Полученную фракцию анализировали электрофо-ретически в 12,5 % полиакриламидном геле с добавлением SDS. По ре-706

зультатам анализа наблюдали наличие двух окрашенных полос в геле, соответствующих молекулярным массам 6400 и 54000 Да. Затем для этих полос проводили триптический гидролиз белка с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом (UltraFlex 2 «Bruker Daltonic GmbH», Германия). Идентификацию полученных белков осуществляли при помощи баз данных SWISS PROT и NCBI. Последовательными 10-кратными разведениями водой концентрацию лектин-аллиназного комплекса (ЛАК) доводили до 10-11 мг/мл (по белку), что соответствует среднему значению диапазона сверхмалых концентраций (10-8-10-15 мг/мл); полученный таким образом препарат использовали в экспериментах.

Обессоленный супернатант концентрировали при 36-40 °С и разделяли на фракции с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) на гидрофобной колонке Kromasil С18 (Россия) (4,6½250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200. Элюцию осуществляли в градиенте концентраций ацетонитрила (296 %) в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты (pH 2,2) со скоростью 1 мл/мин в течение 60 мин. Детекцию проводили при X = 214 нм. Полученные ВЭЖХ-фракции анализировали методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 («Bruker Daltonic GmbH», Германия) с использованием а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. Среди ВЭЖХ-фракций, в большинстве которых пептид 4392 Да (П 4392 Да) был основным компонентом, для дальнейшей работы отбирали фракцию объемом 1 мл с пиком концентрации 40 мкг/мл (по белку). Полученный пептид последовательными 10-кратными разведениями водой доводили до концентрации 10-11 мг/мл (по белку).

Возбудители пирикуляриоза риса Magnaporthe grisea (штамм H5-3, раса 007 с генами вирулентности Av-k^s+ , Av-a⁺ , Av-i⁺ ) и гельминтоспориоза пшеницы и ячменя Вipolaris sorokiniana (штамм Тул-12-1-3) были получены из Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов Всероссийского НИИ фитопатологии. M. grisea выращивали на агаризованной морковной среде 7-10 сут при 24 °С, после чего в ламинарном боксе готовили смыв спор (конидий) (40-50 мл стерильной дистиллированной воды — СДВ, 2-4 чашки Петри). Суспензию концентрировали центрифугированием (10 мин, 8000 об/мин), определяли плотность подсчетом в камере Горяева и при необходимости разбавляли до 10⁵/мл. В. sorokiniana выращивали на картофельно-глюкозном агаре (КГА) 10-12 сут при температуре 24 °С. В ламинарном боксе в чашки с патогеном наливали по 10-15 мл СДВ и микробиологической петлей сбивали споры с воздушного мицелия. Споровую суспензию фильтровали через стерильный ватный фильтр и разводили СДВ до плотности 10³ и 10⁵ спор/мл.

Влияние ЛАК на развитие пирикуляриоза риса оценивали в вегетационном опыте с растениями восприимчивого сорта риса ( Oryza sativa L.) Sha-tiao-tsao (содержит гены полной устойчивости Pi-k^s ). Активность П 4392 Да при гельминтоспориозе пшеницы и ячменя определяли в биотесте с растениями пшеницы сорта Лада и ячменя сорта Зазерский 85. Ростстимулирующий эффект П 4392 Да изучали на следующих культурах: огурец сорта Феникс, горох сорта Сахарный, горчица сорта Радуга, подсолнечник сорта Мастер, чеснок сорта Подмосковный.

При определении активности лектин-аллиназного комплекса (ЛАК) против M. grisea в лунки 96-луночного планшета Cellstar ( « Greiner Bio-One » , Германия) для культур тканей помещали по 45 мкл СДВ или ЛАК и 5 мкл споровой суспензии (10⁵ спор/мл). Образцы инкубировали 24 ч в темноте при 23 °С. В пяти выборках из 100 спор подсчитывали долю проросших.

Определяли среднее по трем опытам. Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Результаты документировали, используя инвертированный микроскоп Leitz Diavert ( « Leica Microsystems GmbH » , Германия).

В вегетационном опыте по оценке влияния ЛАК на развитие пи-рикуляриоза у риса 2-3-суточные проростки высаживали в пластиковые сосуды с нестерильным универсальным питательным грунтом марки «Садовая земля» (объем 0,5 л) и выращивали в теплице 21-24 сут при 18-часовом световом дне, температуре 22/30 °С (ночь/день) и хорошем увлажнении. По достижении стадии 3-го листа растения опрыскивали ЛАК (10^-11 мг/мл по белку; контроль — дистиллированная вода) в количестве 0,5 мл на сосуд и оставляли в тех же условиях. В опыте и контроле использовали по 3 сосуда (по 8 растений в каждом). Через 7 сут после обработки, когда появлялся 4-й лист, его помещали средней частью (длиной 6 см) в инокуляционную камеру. Суспензию спор M. grisea (10⁵/мл; три капли по 20 мкл каждая) наносили на лист с помощью капледержателей (23). Растения выдерживали 22-24 ч в темноте при 23 °С в термостате, затем снимали капледержатели и инокуляционные камеры и возвращали в теплицу. Через 7 сут после инокуляции оценивали симптомы визуально и сканировали листья, используя планшетный сканер Epson Perfection 3200 Photo («EPSON», Япония). Тип реакции растений определяли по 5-балльной шкале F.M. Laterell (24): отсутствие пятен или слабые некрозы — 0, бурые точечные пятна — 1, бурые пятна диаметром 0,5-1 мм с неровными краями — 2, ромбовидные пятна длиной 2-3 мм с коричневым центром — 3, большие ромбовидные серокоричневые пятна со спороношением в центре — 4, распространение токсического эффекта на все растение — 5. Подсчитывали долю (%) капель инокулюма, образовавших совместимые (балл 4, признак восприимчивости) и несовместимые инфекционные пятна (баллы 1-3, признак устойчивости) или не вызвавших симптомов (балл 0, признак устойчивости) (25).

Действие пептида П 4392 Да на В. sorokiniana изучали методом диффузии в агаре (26). По 100 мкл споровой суспензии (10³/мл) помещали в чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром (КГА) и стеклянным шпателем растирали по всей поверхности. В агаре делали три лунки диаметром 8 мм, в которые вносили по 100 мкл раствора пептида (10^-11 мг/мл; контроль — 100 мкл СДВ), и инкубировали в термостате при 26 °С. На 3-и сут измеряли диаметр зон задержки роста. Опыт проводили дважды в 3-кратной повторности. Развитие гельминтоспориозной инфекции при обработке пептидом П 4392 определяли в биотесте по модифицированной методике (26, 27). Отрезки первых полностью развернувшихся листьев пшеницы и ячменя длиной 5-6 см помещали на 1 % агар с бензимидазолом (8-10 шт. на чашку Петри, по 3 чашки в опыте и контроле). На одну половину отрезков наносили по 10 мкл суспензии спор B. sorokiniana в растворе П 4392 Да (концентрация протеина 10^-11 мг/мл, плотность полученной споровой суспензии — 10⁵/мл), на другую — по 10 мкл водной суспензии спор той же плотности (контроль). Результаты учитывали через 7 сут после заражения по числу типичных пятен.

При оценке влияние пептида П 4392 (10-11 мг/мл) на всхожесть семян и стимуляцию роста проростков выборка по каждой культуре состояла из четырех проб по 100 семян (у крупносемянных — по 50). Семена проращивали в чашках Петри на подложке из 2-3 слоев простерилизован-ной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором пептида, располагая рядами на расстоянии не менее 0,5-1,5 см. Чашки помещали в термостат и инкубировали при 25 °С в течение 7-10 сут. Рассчитывали долю проросших семян от их общего числа и измеряли длину корней и стеблей у проростков. 708

Достоверность данных оценивали по t -критерию Стьюдента (STA-TISTICA 6.0, «StatSoft. Inc.», США).

Результаты. При выделении лектин-аллиназного комплекса экстракцию проводили при пониженной температуре (4 °С), что позволило предотвратить неспецифический протеолиз белков. Триптический гидролиз фракций 6400 Да и 54000 Да, полученных после электрофоретического разделения первого хроматографического пика в денатурирующих условиях, и последующая масс-спектрометрия продуктов трипсинолиза показали, что белок с молекулярной массой 6400 Да гомологичен А-цепи маннозоспецифичного агглютинина (лектина) чеснока, а протеин с молекулярной массой 54000 Да представлял собой фермент аллиназу. Таким образом, в указанных условиях нами был выделен лектин-аллиназный комплекс.

Определяя, оказывает ли этот комплекс непосредственное влияние на патоген, выяснили, что как в контроле, так и при обработке ЛАК жизнеспособность спор M. grisea не различалась (80-90 % из них прорастали).

Рис. 1. Развитие некрозов на 4-м листе растений риса ( Oryza sativa L.) сорта Sha-tiao-tsao, чувствительного к пирикуляриозу, в ответ на инокуляцию Magnaporthe grisea при обработке водой (А) и лектин-аллиназным комлексом из растений чеснока посевного ( Allium sativum L.) сорта Подмосковный (Б) : а — капли, не вызвавшие симптомов (балл 0, признак устойчивости), б — образовавшие несовместимые инфекционные пятна (баллы 13, признак устойчивости), в — образовавшие совместимые инфекционные пятна (балл 4, признак восприимчивости) (вегетационный тест; все различия с контролем достоверны при p < 0,01).

Эксперимент, в котором исследовали возможность развития у риса системной устойчивости к пирируляриозу под влиянием ЛАК, показал, что обработка этим комплексом 3-го листа снижала развитие болезни на появившемся позже 4-м листе, что выражалось в уменьшении числа некрозов при сравнении с листьями контрольных (обработка водой) растений (рис. 1).

При фракционировании водно-солевого экстракта из луковиц чеснока посевного высаливанием происходило осаждение крупных белков, тогда как пептиды оставались в растворе (18). С помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ из супернатанта был выделен основной пептид с молекулярной массой 4392 Да (рис. 2.) Изучая влияние этого пептида (П 4392 Да) в концентрации, соответствующей 10-11 мг белка/мл, на В. sorokiniana, мы не обнаружили ингибирования роста колоний. Однако в биотесте на изо- лированных листьях пшеницы и ячменя П 4392 Да демонстрировал способность полностью подавлять или значительно снижать проявление симптомов заболевания на 7-е сут после заражения В. sorokiniana (рис. 3).

Рис. 2. Масс-спектр пептида П 4392 Да, выделенного из растений чеснока посевного ( Allium sativum L.) сорта Подмосковный (Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time of flight mass spectrometry — MALDI-TOF; времяпролетный масс-анализатор UltraFlex 2, «Bruker Daltonic GmbH», Германия; матрица — α -циано-4-гидроксикоричной кислота).

Рис. 3. Развитие темно-бурого гельминтоспориоза на листьях пшеницы сорта Лада (верхний ряд) и ярового ячменя сорта Зазерский 85 (нижний ряд) в ответ на инокуляцию Вipolaris sorokiniana в присутствии пептида П 4392 Да из растений чеснока посевного ( Allium sativum L.) сорта Подмосковный: А, В — контроль (водная споровая суспензия), Б, Г — совместное нанесение спор и П 4392 Да (учет на 7-е сут).

Пептид П 4392 Да не обладал фитотоксичностью по отношению к растениям пшеницы и ячменя, а также гороха, огурца, горчицы, подсолнечника и чеснока (данные не приведены). При этом пептид не влиял на всхожесть семян гороха, подсолнечника, горчицы и огурца, и их проращивание в присутствии пептида не приводило к увеличению длины стеблей и корней проростков. В то же время добавление пептида в концентрации, соответствующей 10-11 мг белка/мл, оказало достоверный положительный 710

эффект при проращивании семян чеснока (повышение всхожести на 13,6 %, р < 0,05). Важно отметить, что при добавлении пептида длина стеблей проростков увеличивалась на 65,5 %, а длина корней была в 4 раза больше кон- трольной (рис. 4).

504                    4°.*

К         о

Рис. 4. Длина корней (а) и стеблей (б) у 10-суточных проростков чеснока посевного ( Allium sativum L.) сорта Подмосковный в присутствии пептида П 4392 Да, выделенного из растений чеснока: К — контроль (вода), О — опыт (раствор пептида).

В литературе описаны разнообразные растительные пептиды с защитными, антимикробными и антифунгальными свойствами (28-31). В основном они представлены катионными пептидами, богатыми цистеином, которые обладают широким спектром действия в отношении растительных патогенов и насекомых-вредителей. Большинство из известных антифунгальных пептидов проявляют прямое действие в микромолярных количествах. Пептид П 4392 Да, выделенный нами из чеснока посевного, отличается от известных намного более низкой эффективной действующей концентрацией и, по-видимому, способностью активировать защитные механизмы растения при заражении патогеном.

Таким образом, из луковиц чеснока посевного ( Allium sativum L.) выделены биологически активные вещества белковой природы, обладающие активностью против ряда фитопатогенов. Как показано в представленной работе, описанный ранее в литературе лектин-аллиназный комплекс (ЛАК) в концентрации, соответствующей 10^-11 мг белка/мл, не оказывает прямого действия на Magnaporthe grisea (возбудитель пирикуляриоза), но снижает поражение листьев риса при заражении этим патогеном, что можно рассматривать как свидетельство в пользу способности индуцировать защитные реакции растения, приводящие к развитию системной устойчивости. Кроме того, нами выявлен пептид с молекулярной массой 4392 Да, который в биотесте в концентрации, соответствующей 10^-11 мг белка/мл, эффективно препятствовал развитию гельминтоспориозной инфекции (возбудитель Вipolaris sorokiniana ) , а также заметно стимулировал прорастание семян и рост проростков у чеснока посевного.