Биологические особенности и методы выявления и идентификации возбудителя бактериального увядания (вилта) кукурузы Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith) Mergaert et al. (обзор)

Бактериальное увядание (вилт) кукурузы, вызываемое бактерией Pantoea stewartii subsp. stewartii , относится к числу экономически значимых заболеваний, способных наносить существенный урон сельскому хозяйству. Регулирование возбудителя в Евразийском экономическом союзе (ЕАЭС) в качестве карантинного объекта обязывает осуществлять фитосанитарный контроль в отношении подкарантинной продукции, поражаемой фитопатогеном. В настоящего время комплексные исследования этого фитопатогена в Российской Федерации носят фрагментарный характер. Также в связи с постоянным обновлением мировой научной информации о растениях-хозяевах, географическом распространении объекта и существующих методах диагностики необходим комплексный анализ международного опыта для полного понимания биологии вредного организма, совершенствования методов его выявления и идентификации.

Цель представленного обзора — комплексный анализ современных сведений о карантинном объекте P. stewartii subsp. stewartii с акцентом на систематизацию данных о его таксономии, географическом распространении, биологических особенностях и путях распространения, а также оценка существующих методов диагностики, определения проблем, препятствующих осуществлению эффективного фитосанитарного контроля, и путей их решения.

Систематическое положение, номенклатура и история открытия фитопатогена. Возбудитель бактериального увядания кукурузы Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith 1898) Mergaert et al. 1993 систематически относится к типу Pseudomonadota , классу Gammaproteobacteria , порядку Enterobacteriales , семейству Enterobacteriaceae и роду Pantoea (1). Подвид представляет собой грамотрицательную, не образующую спор, неподвижную, палочковидную (0,4-0,8 мкм^0,9-2,2 мкм) и факультативно анаэробную бактерию (2). При этом она может становиться подвижной при посеве на питательные среды, то есть обладает способностью менять подвижность в зависимости от условий (3).

Впервые бактерия обнаружена F.C. Stewart в 1894 году (по некоторым источникам в 1895 году) на территории Лонг-Айленда в штате Нью-Йорк (4, 5). F.C. Stewart описал симптомы болезни и выделил бактерию из зараженных растений. В 1897 году культура была направлена E.F. Smith с просьбой определить и уточнить название бактерии. После серии культуральных тестов E.F. Smith описал бактерию как палочку среднего размера, закругленную на концах, с одним полярным жгутиком и дал ей название Pseudomonas stewarti в честь первооткрывателя (6). В публикациях с 1901 по 1909 год E.F. Smith (7, 8) сообщал, что бактерия передается через семена, продемонстрировал наличие возбудителя во всех сосудистых тканях растения и описал культурально-морфологические свойства на питательных средах. L.A. McCulloch (9) в 1918 году, не сумев обнаружить жгутики с помощью специальных красителей, переименовал бактерию в Aplanobacter stewarti (Smith). Позже бактерию переименовали в Phytomonas stewarti (Smith) Bergey et al. (10). В 1910-1935 годы фитопатогену присваивали названия, основываясь преимущественно на культурально-морфологических свойствах (11). Позднее для Pseudomonas stewarti subsp. stewartii были предложены два наиболее часто используемых названия. В 1962 году D.W. Dye описал фитопатогенную бактерию как Erwinia stewartii на основе культурально-морфологических и биохимических свойств (12, 13).

Название Pantoea stewartii было предложено J. Mergaert с соавт. (14) в 1993 году в результате исследования электрофореграмм растворимых белков. Это сравнение также привело к описанию нового подвида Pantoea stewartii subsp. indologenes (2, 14). Тем не менее название Erwinia stewartii Dye 1963 использовали в качестве основного еще длительное время, пока оно не перешло в разряд синонимов.

Географическое распространение и фитосанитарный статус. После открытия и описания болезни в 1894 году P. stewartii subsp. stewartii стремительно распространилась на территории штатов США, где кукуруза выращивалась в коммерческих целях (5). Позднее стали поступать сообщения о болезни из южных регионов Канады (вспышки отмечали в отдельные годы) (15), а также некоторых регионов выращивания кукурузы в Мексике. Среди стран Южной Америки бактериоз распространен в Аргентине, Гайане, Перу и Боливии (16, 17). Активно развивавшаяся в XX веке международная торговля способствовала проникновению возбудителя с зараженными семенами кукурузы из Северной Америки в Евразию, Африку и Австралию. Получаемые в дальнейшем сведения о географическом распространении, а также современный ареал P. stewartii subsp. stewartii тесно связаны с ее фитосанитарным регулированием, поскольку высокая вредоносность фитопатогена сделала его объектом карантина и внимательного контроля в широком перечне стран (см. табл.).

Фитосанитарный статус Pantoea stewartii subsp. stewartii в разных странах

Страна/объединение	|                         Статус                         |	Ссылка
Азербайджан	Отсутствующий карантинный вредный организм	(18)
Алжир	Регулируемый организм	(19)
Аргентина	Регулируемый организм	(20)
Бангладеш	Регулируемый организм	(21)
Бахрейн	Регулируемый карантинный организм	(22)
Бенин	Регулируемый вредный организм	(23)
Ботсвана	Регулируемый карантинный вредный организм	(24)
Бразилия	Отсутствующий карантинный вредный организм	(25)
Буркина-Фасо	Ограниченно распространенный карантинный организм	(26)
Вьетнам	Регулируемый организм	(27)
Гватемала	Регулируемый карантинный объект	(28)
Гвинея	Регулируемый организм	(29)
Гвинея-Бисау	Отсутствующий карантинный организм	(30)
Грузия	Отсутствующий карантинный вредный организм	(31)
Египет	Регулируемый карантинный организм	(32)
Зимбабве	Регулируемый организм	(33)
Израиль	Карантинный вредный организм	(34)
Индия	Регулируемый вредный организм	(35)
Индонезия	Карантинный объект	(36)
Иордания	Регулируемый присутствующий карантинный организм	(37)
Иран	Отсутствующий карантинный организм	(38)
Йемен	Регулируемый организм	(39)
Канада	Ограниченно распространенный карантинный организм	(40)
Катар	Вредный организм, запрещенный к ввозу	(41)
Кения	Условия отсутствия в продукции и происхождение из свободных зон	(42)
Китай	Регулируемый организм	(43)
КНДР	Карантинный вредный организм	(44)
Колумбия	Регулируемый присутствующий вредный организм	(45)
Демократическая Республика Конго Регулируемый организм		(46)
Куба	Отсутствующий карантинный организм	(47)

Продолжение таблицы

Страны Персидского залива Лаос Маврикий Мадагаскар Малайзия Мали Мексика Мозамбик Монголия Молдова Намибия Никарагуа Парагвай Республика Северная Македония Сенегал Сербия Сирия Судан Таиланд Тайвань Танзания Того Тунис Туркменистан Турция Уганда Узбекистан Украина Уругвай Чили Шри-Ланка Эквадор Эфиопия ЮАР Япония ЕАЭС APPPC COSAVE EPPO EU IAPSC PPPO

Отсутствующий карантинный организм                    (48) Карантинный объект                                    (49) Карантинный объект                                    (50) Карантинный вредный организм                          (51) Карантинный объект                                    (52) Карантинный вредный организм                          (53) Карантинный объект                                    (54) Карантинный объект                                    (55) Карантинный объект                                    (56) Регулируемый вредный организм                         (57) Условие происхождения из свободных зон                 (58) Отсутствующий регулируемый вредный организм           (59) Карантинный объект                                    (60) Регулируемый вредный организм                         (61) Карантинный организм                                  (62) Отсутствующий регулируемый вредный организм           (63) Отсутствующий карантинный организм                    (64) Карантинный вредный организм                          (65) Условие происхождения из свободных зон                 (66) Регулируемый организм                                  (67) Карантинный организм                                  (68) Регулируемый некарантинный организм                   (69) Карантинный организм                                  (70) Отсутствующий карантинный организм                    (71) Отсутствующий регулируемый вредный организм           (72) Карантинный организм                                  (73) Отсутствующий карантинный организм                    (74) Отсутствующий карантинный организм                    (75) Отсутствующий карантинный организм                    (76) Карантинный вредный организм                          (77) Регулируемый организм                                  (78) Отсутствующий карантинный вредный организм           (79) Отсутствующий карантинный организм                    (80) Регулируемый организм                                  (81) Условие происхождения из свободных зон                 (82) Отсутствующий карантинный вредный организм           (83) Ограниченно распространенный карантинный организм     (16) Ограниченно распространенный карантинный организм Ограниченно распространенный карантинный организм Отсутствующий карантинный организм Отсутствующий карантинный организм Отсутствующий карантинный организм

Примечание. ЕАЭС — Евразийский экономический союз, APPPC — Asia and Pacific Plant Protection Commission (Азиатско-Тихоокеанская комиссия по защите растений), COSAVE — the Plant Protection Committee for the South Cone (Комитет по защите растений Южного Конуса), EPPO — European and Mediterranean Plant Protection Organization (Европейская и Средиземноморская организация по защите растений), EU — European Union (Европейский союз), IAPSC — Inter-African Phytosanitary Council (Межафриканский фитосанитарный совет), PPPO — Pacific Plant Protection Organization (Тихоокеанская организация по защите растений).

По последним имеющимся данным, возбудитель бактериального увядания кукурузы присутствует в Африке, Северной и Южной Америке, а также в Евразии (16).

На Евразийском континенте, по данным Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР, The European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO), ситуация с распространением P. stewartii subsp. stewartii различается.

Так, в Австрии в 1992 году опубликовано первое сообщение об обнаружении возбудителя, после чего во всех районах выращивания кукурузы в течение трех лет проводились обследования по результатам которых выявить и подтвердить бактериальное увядание кукурузы не удалось (16, 17). В Польше после перехвата партии зараженных семян кукурузы из Италии в 2013 году около 200 образцов семян были собраны с полей по всей стране в рамках фитосанитарного мониторинга, однако по результатам проведенных тестов подтвердить наличие P. stewartii subsp. stewartii не удалось (16, 17).

В Италии вплоть до 1950-х годов серьезный ущерб урожаю в регионе

Венето наносился вследствие использования семенного материала, импортированного из США (17). В 1980-х годах также отмечались отдельные очаги болезни, статус которых впоследствии был определен как «ликвидированные» (17). Позднее бактерия была обнаружена во время официальных мониторинговых обследований, проведенных на посевах кукурузы в Венеции летом 2017 года. Площадь очага составила около 7 га, на зараженной территории и в окрестностях кукуруза выращивалась только на кормовые цели (17, 84, 85).

В 2018-2022 годах отмечались вспышки бактериального увядания в различных регионах выращивания кукурузы (16). Официальный статус P. stewartii subsp. stewartii в Италии в настоящее время обозначен как «присутствует, промежуточная ситуация»; согласно последним данным, выявленные очаги находятся в стадии ликвидации (16). Такой же статус патогена отмечается в Словении, где P. stewartii subsp. stewartii впервые была обнаружена в 2018 году на посевах кукурузы вблизи города Нова Горица (Nova Gorica). После ликвидации очага вспышки болезни отмечались в западной части Словении, а также по меньшей мере в четырех местах в том же административном районе, что и первый очаг (статус очагов на стадии ликвидации) (16, 17).

На территории Украины бактериальное увядание кукурузы впервые обнаружено в 2014 году в Полтавской области на площади около 100 га. К 2018 году общая зараженная площадь оценивалась примерно в 3500 га в различных регионах страны, также отмечалось, что очаги находятся на стадии ликвидации. В настоящее время статус изменился на «присутствует, промежуточная ситуация» (17).

В ряде стран карантинный объект, по последним данным, отсутствует или ликвидирован. Так, в Греции (ЕОКЗР проведена оценка статуса на основе информации от 1992 года), Румынии (подробного описания ситуации нет, ЕОКЗР проведена оценка статуса на основе информации от 1992 года), Хорватии (информация от 1996 года) и Нидерландах (информация от 2017 года) данные подтверждены обследованиями. Объект «отсутствует» в Бельгии (нет данных о присутствии/отсутствии вредных организмов) (17).

В Азии подтвержденными считаются несколько случаев выявления возбудителя в КНР, Южной Корее, Индии, Иордании, Тайиланде, Малайзии и на Филиппинах без подробного описания (16).

На Африканском континенте в 2013 и 2014 годах в основных регионах выращивания риса в Того (Ковье, Kovi e и Кпалиме, Kpalim e ) бактерия P. stewartii была выявлена на растениях риса. Этот случай был первым обнаружением возбудителя бактериального увядания (вилта) кукурузы на рисе, однако подтвердить, какой именно подвид вызвал поражение, не удалось (16, 86). В 2011 и 2015 годах авторы также выявили P. stewartii в регионах выращивания риса в Бенине, при этом установить принадлежность подвида с точной достоверностью так и не удалось. По последним данным ЕОКЗР, в Бенине и Того статус объекта — «присутствует, ограниченное распространение» (16, 86).

В 2025 году было опубликовано сообщение об обнаружении фитопатогена в Иране, где в результате обследования полей кукурузы удалось выявить P. stewartii subsp. stewartii и выделить в чистую культуру (87).

Симптомы болезни, вредоносность и пути распро- странения. F.C. Stewart в 1897 году описывал симптомы болезни как увядание и последующий некроз листьев (рис. 1, А, Б), а в некоторых случаях и как гибель всего растения кукурузы (4).

Рис. 1. Симптомы бактериального увядания (вилта) кукурузы, вызванного Pantoea stewartii subsp. stewartii , по данным различных источников: а — общий вид растения с симптомами, б — всходы с симптомами увядания, в — срез стеблей с потемнением и отмиранием сосудистой системы растения (11, 88) .

Рис. 2. Симптомы бактериального увядания (вилта) кукурузы, вызванного Pantoea stewartii subsp. stewartii : а — хлоротичные полосы на листьях кукурузы, б — проявление симптомов увядания, в — симптомы вдоль жилкования листа (фото А.Б. Яремко, интродукционно-инфекционный участок, ФГБУ ВНИИКР, Московская обл.).

Также он отмечал характерный симптом: из-за обильного числа бактерий в сосудистой системе при разрезании стебля сосудистые пучки были желтыми и чередовались с черными штрихами вследствие отмирания (см. рис. 1, В). Если срезанный стебель оставляли на некоторое время в таком состоянии, из сосудистых тканей выделялись капли экссудата (4).

Симптомы можно наблюдать в любую фазу развития растения, но чаще всего их фиксируют в фазу цветения—выметывания метелок. На листьях образуются хлоротичные полосы от светло-зеленого до белого цветов вдоль жилкования, позднее пораженные участки высыхают и желтеют, возможно отмирание и выпадение таких участков, а в ряде случаев — отмирание всего листа (рис. 2, А, В) (17, 89, 90). Подобные симптомы часто наблюдаются у растений от фазы выметывания метелок до созревания початков. Они возникают из-за переносчиков бактерии.

Переносчиком бактерии в США были кукурузные листоблошки ( Chaetocnema pulicaria Melsheimer, 1847), которые способствуют распространению патогена на большие расстояния в течение всего периода вегетации растений (90-92). Бактерия при этом проникает в растения через повреждения, вызываемые листоблошками, затем попадает в межклеточное пространство листа, а также в ксилему, вызывая тем самым так называемые «водянистые» поражения и увядание листьев (93). По данным литературы, выделяют и других переносчиков, таких как Chaetocnema denticulata (Illiger, 1807), Diabrotica undecimpunctata howardi Barber, 1947, Diabrotica longicornis (Say, 1824), Delia platura (Meigen, 1826), Agriotes mancus (Say, 1823), и Phyl-lophaga sp. (17). Однако достоверных данных о том, что эти насекомые-переносчики могут способствовать распространению P. stewartii subsp. stewartii , в настоящее время не существует.

Характерное увядание и поражение сосудистой системы может происходить на любой стадии развития растений кукурузы, но наибольшую опасность патоген представляет для всходов в фазу 2-3 листьев, поскольку такие растения быстро увядают и чаще всего погибают (см. рис. 2, Б). Если растение выживает, в течение вегетации можно наблюдать отставание в росте, отсутствие образования початков или уменьшение урожайности и выхода зерна с одного растения.

Разные виды кукурузы поражаются в неодинаковой степени (8, 94, 95). Так, при сравнении интенсивности поражения зубовидная кукуруза Zea mays var. indentata (Sturtev.) L.H. Bailey, как правило, менее восприимчива к увяданию, чем сахарная Zea mays var . saccharata (Sturtev.) L.H. Bailey. Ранее также сообщалось о значительных потерях урожая у восприимчивых и умеренно восприимчивых гибридов сахарной кукурузы (94, 96).

Отмечается, что кукуруза служит основным растением-хозяином для P. stewartii subsp. stewartii. Известно, что бактерия также может вызывать бактериальное увядание сахарного тростника ( Saccharum sp.) (97), бронзо-вость листьев джекфрута ( Artocarpus heterophyllus Lam.) (98-101), бактериальное увядание (вилт) драцены Сандера ( Dracaena sanderiana Mast.) (102), бактериальный ожог листьев риса ( Oryza sativa L.) (103) и предположительно может поражать другие растения семейства Poaceae (достоверные данные отсутствуют) (8, 16). При отсутствии видимых симптомов на вегетирующих растениях бактерия присутствует в латентной форме и в дальнейшем сохраняется в семенах кукурузы до трех лет (104). Согласно C.C. Block с соавт. (105), бактериальная инфекция локализуется в сосудистой ткани в основании семени, в эндосперме и снаружи на семенной оболочке, но не внутри зародыша. Другие исследователи упоминают, что бактерия может достичь зародыша, если семена формируются на восприимчивых растениях (17, 106).

Многие страны Европы и Азии ввели строгие карантинные правила при импорте семян кукурузы из регионов, где присутствует возбудитель (107). При этом не остается сомнений в вопросе вредоносности P. stewartii subsp. stewartii , ведь в годы эпифитотий она может достигать на восприим-26

чивых сортах сахарной кукурузы до 100 %, на более устойчивых сортах — 30-80 % (107).

Экономическая значимость болезни в Северной Америке с 1930-х годов снизилась, что связано прежде всего с появлением более устойчивых гибридов и постоянным использованием системных инсектицидов против насекомых — переносчиков бактерии. Несмотря на то, что вероятность передачи инфекции с коммерческими партиями семенного материала достаточно низкая, сохраняется определенный риск при выявлении зараженных семян (108).

Первые данные о передаче бактерии семенами продемонстрировали C.C. Block с соавт. (109). По результатам исследований, частота передачи бактерии с семенами составила 0,022 % от семян, зараженных естественным путем (одно зараженное растение из 4563 зараженных семян) (109). Позже P.M. Michener с соавт. (110) сообщили о схожей частоте передачи бактерии с семенами — 0,038 % (22 зараженных растения из 58300 зараженных семян).

В 2019 году были опубликованы данные о построении концептуальной количественной модели рисков проникновения возбудителя бактериального увядания кукурузы. Единственным путем проникновения, рассматриваемым в модели, был импорт в Европейский Союз (ЕС) семян кукурузы для посева из США (108). При моделировании учитывались все данные по передаче бактерии растениям из семян, опубликованные ранее, и представлялись различные сценарии развития при проникновении бактерии на территорию ЕС. Согласно этой количественной модели, вероятность заноса патогена представляется незначительной (108, 110, 111). Также отмечено, что вероятность проникновения зависит не только от распространенности бактериоза в месте происхождения и скорости передачи от растения к семенам и от семян к растениям, но и от ежегодного потока импортируемых семян.

На сегодняшний день для подтверждения отсутствия P. stewartii subsp. stewartii репрезентативная выборка для проведения лабораторных исследований составляет 400 семян от партии (согласно стандарту ЕОКЗР PM 7/060(2) 2016) (89, 112). Такой размер выборки не подходит для обнаружения патогена на уровнях распространенности (например, если имеется одно зараженное семя на 1 000 000 или одно инфицированное семя на 100 000 000 семян), которые можно ожидать, согласно представленной модели (108). То есть необходим пересмотр репрезентативной выборки для проведения лабораторной диагностики в лабораториях. В связи с этим группой экспертов Европейского агентства по безопасности продуктов питания (European Food Safety Authority, EFSA) по здоровью растений было предложено увеличить размер выборки тестируемых семян из стран, где бактериальное увядание (вилт) кукурузы распространено или имеет ограниченное распространение, но в импортируемых партиях семян кукурузы их точное число для выборки не было определено (108).

В настоящее время бактериальное увядание кукурузы по-прежнему остается серьезной проблемой, особенно в случаях производства семян для экспорта. Свыше 100 стран ввели фитосанитарные ограничения на импорт семян кукурузы и требуют подтверждения отсутствия в партиях возбудителя бактериального увядания посредством фитосанитарной сертификации. Фитосанитарные ограничения оказывают существенное влияние на сферу семеноводства и торговую сферу с точки зрения затрат на тестирование семенного материала кукурузы и потенциальную потерю экспортных рынков в случае выявления объекта. Следовательно, быстрое и точное обнаружение P. stewartii subsp. stewartii в семенном материале имеет важное значение для предотвращения распространения бактерии (108, 111, 112).

Методы выявления и идентификации. Недостатки современной диагностики P. stewartii subsp. stewartii обусловлены отсутствием достоверных и высокоэффективных методов идентификации, которые позволили бы не только выявлять бактерии в семенном и посадочном материале, но и проводить дифференциацию. Связано это, прежде всего, с низкой чувствительностью существующих методов, а также с генетическими и культурально-морфологическими особенностями фитопатогена. Существует группа других близкородственных бактерий, которые могут присутствовать на растениях кукурузы и влиять на специфичность тестов, используемых в мировой практике. Среди близкородственных бактерий отмечается непатогенный для кукурузы подвид Pantoea stewartii subsp. indologenes Mergaert et al. 1993, который может быть обнаружен на семенах, а также в растениях как резидентная бактериальная микробиота (113). Следовательно, при диагностике возбудителя бактериального увядания возникает риск получения ложноположительных результатов.

Множество методов были разработаны для обнаружения P. stewartii subsp. stewartii в зараженных растительных тканях или семенах, а также для идентификации бактериальной культуры (113-115).

Из серологических методов часто применяются иммунофлуорес-центный (ИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА) (13) с использованием поликлональных или моноклональных антител (86). Недостаточная чувствительность и специфичность делает метод ИФ неприменимым для прямого выявления P. stewartii subsp. stewartii в растительном материале, в связи с чем используется в некоторых лабораториях только для идентификации чистой культуры возбудителя. ИФА-диагностика бактериального увядания кукурузы широко применяется в США при коммерческой сертификации семян (89). Следует отметить, что этот метод в лабораторной практике используют как отборочный, поэтому он не перспективен как основной метод идентификации. C.C. Block с соавт. (116) обнаружили, что ИФА, а также девять опубликованных методов ПЦР показали ложноположительные результаты с различными изолятами рода Pantoea , выделенными из семян тропической или субтропической кукурузы. Позднее изоляты были идентифицированы с помощью мультилокусного секвенирования (multilocus sequence typing, MLST) как P. stewartii subsp. indologenes (117).

S.P. Thapa с соавт. (118) разработали мультиплексную ПЦР для P. stewartii subsp. stewartii с тремя парами праймеров для трех разных участков генов: wtsE («водянистые» поражения), cpsA (продуцирование внеклеточного полисахарида) и hrpN (реакция гиперчувствительности у растений, не являющихся растением-хозяином). Каждая пара праймеров была определена как специфичная для P. stewartii subsp. stewartii (118).

Позднее J. Nechwatal с соавт. (119) при валидации мультиплексной ПЦР в соответствии с S.P. Thapa с соавт. (118), показали наличие ложноположительных реакций с P. stewartii subsp. indologenes . Также в рекомендованном диагностическом протоколе ЕОКЗР PM 7/60 (EPPO 2016) часть тестов показала ложноположительные результаты (119). J. Nechwatal с соавт. (119) провели оценку нескольких наборов праймеров и пришли к выводу, что праймеры, ориентированные на участок гена galE (ген, кодирующий 28

UDP-глюкозо-4-эпимеразу) согласно I . Gehring с соавт. (120), позволяли дифференцировать два подвида методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на основе однонуклеотидного полиморфизма (single nucleotide polymorphism, SNP). SNPs присутствуют в качестве последнего основания на 3'-конце прямого и обратного праймеров (119). Праймеры на основе участка гена galE были проверены на изолятах P. stewartii subsp. indologenes , выделенных из семян и вегетативных частей растений кукурузы, и семи изолятах из других растений-хозяев (119, 120). Были получены ложноположительные реакции в этом тесте с другими изолятами P. stewartii subsp. indologenes , выделенными в различных регионах. В настоящее время мало что известно об изменчивости P. stewartii subsp. indologenes , при этом существуют риски ложноположительных результатов ПЦР с праймерами, основанными на различиях в одной паре SNP (113). В связи с большой гетерогенностью подвида indologenes при лабораторных исследованиях нельзя обойтись без подтверждающих тестов на основе методов определения биохимических, генетических и патогенных свойств бактерий.

N. Pal с соавт. (113) изучили 26 штаммов P. stewartii subsp. stewartii , 17 штаммов P. stewartii subsp. indologenes , 11 штаммов P. agglomerans , 13 штаммов P. ananatis и других штаммов родов, близких к Pantoea spp. Подобранные авторами праймеры, основанные на межгенной области генов cpsA (кодирует WceG, белок гликозилтрансферазы) и c psB (кодирует Wza, пе-риплазматический белок, который участвует в экспорте экзополисахарида стевартана EPS) сравнивали с ранее представленными тест-системами для выявления и идентификации возбудителя бактериального увядания кукурузы (113). В результате все тест-системы, с которыми сравнивали разработанные праймеры, показали ложноположительные реакции с подвидом indologenes , а в случае некоторых тест-систем также регистрировали кроссреакции со штаммами P. ananatis и частично со штаммами P. agglomerans . Стоит отметить, что виды P. ananatis и P. agglomerans довольно часто обнаруживаются в растительных экстрактах кукурузы и других зерновых культур (121).

Результаты сравнения ИФА и девяти ПЦР-тестов добавили важную информацию и подтвердили выводы более ранних исследований (119, 120, 122). Было продемонстрировано, что ни один из тестов для обнаружения P. stewartii subsp. stewartii не достоверен на 100 % (113, 116). Несмотря на то, что все методы позволяют легко обнаружить P. stewartii subsp. stewartii , они также демонстрируют ложноположительные результаты, особенно с ДНК P. stewartii subsp. indologenes и некоторыми изолятами P. ananatis , P. agglomerans (113). По имеющимся данным, между двумя подвидами P. stewartii наблюдается высокая гомология последовательностей ДНК в сайтах связывания праймеров, что становится проблемой при разработке надежных тест-систем, позволяющих отделять подвиды друг от друга (113). P. stewartii subsp. indologenes обитает на растениях не только как эндофит, но может также вызывать заболевания: пятнистость листьев могара и проса (14), гниль ананаса (14), центральную гниль лука (123). Бактерию удавалось обнаружить в воде, почве, и у нее может быть более гетерогенный геном (124), чем у P. stewartii subsp. stewartii как узко специализированного фитопатогена.

В работе N. Pal с соавт. (113) 7 штаммов P. stewartii subsp. indologenes, полученные от растений-хозяев (не кукурузы), показали отрицательный результат при исследовании методом ИФА, а 9 из 10 штаммов, выделенных из семян кукурузы, показали положительный результат. То есть представлено различие между выделенными изолятами в зависимости от вида растения, на котором бактерия изначально была обнаружена (113). Были подобраны праймеры, основанные на участке гена galE (120), которые, как утверждают авторы, могут быть использованы для идентификации патогена и позволяют распознавать подвиды P. stewartii, но результаты зависят от различий в одной паре оснований. Тест потребует дополнительного этапа секвенирования ампликонов для подтверждения наличия специфичных SNP galE, поскольку метод электрофореза не обладает достаточными характеристиками для визуализации различий. Более того, постоянное наличие SNP еще недостаточно подтверждено и требует дополнительной проверки на различных штаммах P. stewartii subsp. indologenes, полученных из семян кукурузы, а также, возможно, и других изолятов, выделенных из различных растений-хозяев.

Анализ существующих молекулярно-генетических методов показывает, что наиболее перспективным остается ПЦР-РВ, способный обеспечивать прямое выявление P. stewartii subsp. stewartii в растительном материале и дифференцировать ее с близкородственными бактериями. Применимость такого метода напрямую зависит от генетического разнообразия и эволюции штаммов Pantoea spp. и требует периодической актуализации.

С.И. Приходько с соавт. (125) применяли подход сравнительной геномики при разработке специфичных пар праймеров для обнаружения бактериальных патогенов. Используя сборки геномов из базы GenBank NCBI, корейские исследователи K.Y. Baek с соавт. (126) сравнили геномы P. stewartii subsp. stewartii и близкородственных видов бактерий и получили несколько пар праймеров на основе гипотетических белков; праймеры в последующем были апробированы и показали надежные результаты в отношении специфичности.

Для дифференциации подвидов P. stewartii также разработаны другие, более сложные методы. Q. Wu с соавт. (127) для выявления различий в профилях экспрессии белков двух подвидов использовали протеомный подход. Метод генотипирования, разработанный R. Xu с соавт. (128), включает ДНК-фингерпринтинг. В диагностическом протоколе ЕОКЗР (PM 7/60 (2) 2016) в качестве метода идентификации P. stewartii subsp. stewartii предлагается анализ профилей жирных кислот бактерий с помощью системы MIDI (США) и оборудования компании «Agilent Technologies» (США) (89, 129, 130). Перечисленные методы трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и специальных знаний и не подходят для рутинной проверки образцов в испытательных и исследовательских лабораториях. Метод мультило-кусного секвенирования (MLST), описанный J.T. Tambong (120), включает реакции ПЦР, процедуру описания изолятов бактерий с использованием последовательностей фрагментов генов, обычно семи генов домашнего хозяйства (117, 128). Этот метод рассчитан на готовую базу данных и оказывается довольно затратным при диагностике в исследовательских и испытательных лабораториях (132-134).

A. Wensing с соавт. (135) для анализа белковых профилей использовали времяпролетную масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS). По результатам анализа белковых профилей P. stewartii subsp. stewartii дифференцировался от таких видов, как P. agglomerans, P. dispersa и P. ananatis (135). Анализ белковых профилей P. stewartii subsp. stewartii и P. stewartii subsp. indologenes не позволял достоверно их дифференцировать. Следует учитывать, что для эффективного применения MALDI-TOF MS и точной идентификации требуется наличие в библиотеке прибора максимально возможного количества белковых профилей искомой бактерии и близкородственных подвидов, а также видов (136).

Иммуноферментный анализ для диагностики P. stewartii и ее подвидов широко используется для фитосанитарной сертификации семян, но сам метод обладает низкой специфичностью и чувствительностью. Разработанный N. Pal с соавт. (113) метод ПЦР-РВ с интеркалирующим красителем SYBR рассматривается авторами как отдельный тест, который может использоваться в сочетании с ИФА. Партии семян кукурузы с положительным результатом ИФА могут быть дополнительно исследованы на наличие P. stewartii subsp. stewartii с помощью ПЦР-РВ или классической ПЦР либо обоими методами.

В 2023 году в Италии, где возникновение очагов бактериального увядания кукурузы остается актуальной проблемой, были разработаны праймеры на основе собранных геномов итальянских изолятов P. stewartii subsp. stewartii и P. stewartii subsp. indologenes . При сравнении геномов подвидов P. stewartii были отмечены множественные интрогрессионные события. Полученные результаты позволили разработать специфический молекулярный тест, при валидации которого в семенном материале получена чувствительность 10³ КОЕ/мл (137). Однако во избежание ложноположительных реакций необходимо не забывать про альтернативные методы подтверждения присутствия P. stewartii , в частности биохимические методы и тест на патогенность. Так, описана специфическая реакция P. stewartii subsp. stewartii (гидролиз эскулина и индола на питательной среде) в сравнении с различными видами Pantoea (138, 139).

Таким образом, комплексный анализ современного состояния сведений о возбудителе бактериального увядания (вилта) кукурузы показывает, что с 1993 года фитопатоген сохраняет валидно описанное научное название Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith 1898) Mergaert et al. 1993 в рамках семейства Enterobacteriaceae . Несмотря на фитосанитарный контроль со стороны более чем 60 стран и попытки искоренения популяций этого карантинного объекта, возникают его новые очаги. Современный ареал охватывает все континенты, где выращивается кукуруза, и распространяется на такие страны, как США, Канада, Аргентина, Гайана, Перу, Боливия, Бенин, Того, Словения, Италия, Иран, КНР, Южная Корея, Индия, Иордания, Таиланд, Малайзия и Филиппины. Риск дальнейшего распространения патогена напрямую связан с международной торговлей семенным материалом и наличием насекомых — переносчиков возбудителя, что требует применения мер фитосанитарного контроля. Основное препятствие для выявления возбудителя бактериального увядания кукурузы — это отсутствие доступного и на 100 % специфичного диагностического метода. Существующие коммерческие наборы ИФА и многие молекулярные (ПЦР) тесты демонстрируют ложноположительные реакции с близкородственными непатогенными для кукурузы бактериями. Ошибочная идентификация приводит к значительным экономическим потерям в семеноводствае сельскохозяйственных культур. Часто для проведения диагностики возбудителя требуется применение не одного метода, а нескольких независимых тестов.

Существующие высокоточные методы (например, мультилокусное секвенирование и анализ профилей жирных кислот) по-прежнему остаются малодоступными для рутинного использования в лабораторной диагностике из-за высокой стоимости, сложности и необходимости применения специального оборудования. В этой связи при исследовании образцов на наличие возбудителя бактериального увядания кукурузы необходимо опираться на совокупность методов, основанных на разных биологических принципах. Представленный обзор консолидирует актуальные научные данные и четко определяет стратегические направления прикладных фитосанитарных исследований по снижению рисков, связанных с возбудителем бактериального увядания кукурузы P. stewartii subsp. stewartii .

1 ФГБУ Всероссийский центр карантина растений, 140150 Россия, Московская обл., м.о. Раменский, пгт. Быково, ул. Пограничная, 32,