Биологические свойства цитомединов, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопотерю

Острая кровопотеря представляет собой едва ли не самое распространенное повреждение организма на пути эволюции человека и является одной из актуальных проблем современной медицины [6]. В ответ на кровотечение возникает комплекс компенсаторных и патологических реакций [3].

Известно, что кровопотеря сопровождается активацией системы иммунитета, это проявляется в возникновении «активированных лимфоцитов», увеличении уровня антител, активацией реакции неспецифического иммунитета [1, 2, 5]. Основное место в регуляции системы иммунитета отводится медиаторам, в том числе щелочным полипептидам - цитомединам, которые являются пептидами межклеточной регуляции и обеспечивают гомеостаз организма. Последние образуются в клетках различных органов в результате катапсинового протеолиза, проникают в жидкие среды организма и способны специфическим образом через рецепторы воздействовать на лимфоциты [4, 5, 6, 7, 8].

Одним из перспективных направлений исследования адаптационных реакций организма в ответ на острую кровопотерю является изучение свойств эндогенных пептидов (цитомединов), продуцируемых органами, тканями и клетками, способных вмешиваться в реализацию самых различных функций организма [3, 4, 6, 9].

Целью настоящего исследования явилось изучение биологических свойств пептидов, выделенных из печени и сердца животных, перенесших острую кровопотерю.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на 20 животных (бараны). Все животные были разделены на 2 группы: опытные (10 баранов), которым пунктировали яремные вены и извлекали кровь в объеме, равном 30% ОЦК за 5 дней до забоя, и контрольные - без предварительного кровопускания (10 баранов). Забой проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с исполь зованием экспериментальных животных» (Приложение 4 к Приказу М3 СССР №755 от 12. 08. 1977). Для получения цитомединов были взяты внутренние органы баранов - ткани печени и сердца. Выделение цитомединов проводилось методом уксусно-кислой экстракции с последующим осаждением комплекса полипептидов ацетоном (Морозов, Хавинсон, 1999).

Нами проводилось исследование биологической активности цитомединов на 24 образцах крови доноров (16 мужчин и 8 женщин) в возрасте от 31 до 55 лет (средний возраст 39,б±1,7), не имеющих соматических, психических заболеваний, и 30 образцах крови пациентов со вторичными иммунопатологическими состояниями (20 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 19 до 59 лет (средний возраст 40,4±2,4). Группа больных представлена пациентами АУ РБ Республиканского клинического госпиталя для ветеранов войн, ГУ Республиканской клинической больницы г. Улан-Удэ. У всех больных диагноз ХОБЛ подтвержден данными анамнеза, клиники, функциональных и рентгенологических методов исследований в соответствии с Федеральной программой по ХОБЛ (Москва, 2004), рекомендациями Европейского респираторного общества по ХОБЛ (Consensus Statement of the European Respiratory Society, 2003) GOLD (Global Initiative for Obstructive Lung Disease, 2008). Наличие вторичного иммунодефицитного состояния выявлялось по результатам иммунологического исследования.

Перед проведением исследования опытные порошки (цитомедины) растворяли в соотношении 100 мкг в 1,0 мл физиологического раствора. Для инкубации с лимфоцитами бралось 0,1 мл раствора. Длительность инкубации составляла 60 мин. Полученные результаты выражали в кл/мкл. Лимфоциты выделялись на градиенте Фиколл-урографин с плотностью 1,077 г/см3, дважды отмывались средой 199 или раствором Хенкса. Выявление поверхностных маркеров лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ и CD 16+) проводили с помощью моноклональных антител реакцией иммунофлюоресценции (РИФ). Использовали моноклональные антитела (ТОО «МедБиоСпектр», Москва). Оценку реакции осуществляли по проценту светящихся клеток. Анализировалась динамика изменений CD-маркеров лимфоцитов, инкубированных с «контрольными» и «опытными» пептидами в среде роста RPMI-1640. В качестве контроля проводили аналогичные тесты с введением физиологического раствора.

Полученные данные были обработаны статистически общепринятыми методами с применением пакета прикладной программы «BIOSTAT» и программы статистического анализа Microsoft Excel, версия ХР. Исследуемые параметры приведены в виде средних величин со стандартным отклонением М± SD, где М -среднее значение, SD - среднее квадратичное отклонение. Для анализа нормальности распределения данных применялся параметрический t-критерий Стьюдента; если гипотеза нормальности отвергалась, показатель достоверности вычислялся с помощью рангового непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Прежде всего мы решили выяснить, как влияют пептиды, полученные до и после кровопотери из внутренних органов животных, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов.

Известно, что введение цитомединов в организм существенным образом меняет иммунологический потенциал. Цитомедины модулируют течение реакций как врожденного, так и адаптивного иммунитета [4]. Последнее представляет максимальный интерес, т.к. специфический иммунитет наиболее эффективен в повышении антибактериальной резистентности организма. Поэтому в первую очередь мы решили оценить биологические свойства цитомединов, выделенных из печени и сердца как интактных, так и перенесших кровопотерю баранов. Причем лимфоциты-индикаторы выделяли из крови как доноров, так и больных с явлениями иммунодефицита.

Таблица 1

Изучаемые показатели (хЮ3кл/мкл)	Лимфоциты доноров			Лимфоциты больных
	Физиологический раствор (контроль)п=24	Контрольные пептиды (опыт I) п=24	Опытные пептиды (опыт II) п=24	Физиологический раствор (контроль) п=30	Контрольные пептиды (опыт I) п=30	Опытные пептиды (опыт II) п=30
Т-лимфо-циты CD3+ Pi Р2 Рз	ОДНО,09	0,58±0,1	0,53±0,12	0,63±0,21	1,ОНО,18 <0,05	1,06±0,12 <0,05
Т-хелперы CD4+ Pi Р2 Рз	0,48±0,04	0Д7±0,11	0,5±0,1	ОДНО,12	0,72±0,2 <0,05	0,76±0,21 <0,05
Т-лимфо-циты CD8+ Pi Р2 Рз	0,33±0,07	0,35±0,06	0,3 НО ,05	0,24±0,06	0,38±0,03 <0,05	0,37±0,08 <0,05
В-лимфоци-ты CD22+	0,3 НО,04	0,37±0,13	0,38±0,11	0,26±0,03	ОДНО ,21	0,35±0,09
NK CD16+ Pi Р2 Рз	0.41 ±0.07	0,27±0,1 <0,05	0,29±0,12 <0,05	0,23±0,05	ОДНО,08 <0,05	0,45±0,06 <0,05

Примечание:

Р] - достоверность различий между контролем и опытом I; р2- достоверность различий между опытом I и опытом II;

Рз _ достоверность различий между контролем и опытом II

Влияние пептидов из печени животных, полученных до и после кровопотери, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов доноров и больных (M±SD)

В таблице 1 представлены данные по динамике экспрессии CD-маркеров лимфоцитов доноров под влиянием пептидов, полученных из печени баранов до и после кровопотери. Как видно, пептиды, выделенные из печени практически не оказывают эффекта на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов.

Несколько иная картина обнаруживается при анализе результатов исследования лимфоцитов больных. Оказалось, что интактные цитомедины усиливают экспрессию маркеров CD3+ (pi<0,05), CD4+ (Р1<0,01), CD8+ (Р1<0,02), CD16+ (pi<0,05). Вместе с тем подобный эффект выявлен и у «опытных» цитомединов. Так, пептиды, выделенные из печени баранов, перенес ших кровопотерю, усиливают по сравнению с исходными данными экспрессию маркеров CD3+ (р3<0,05), CD4+ (р3<0,05), CD8+ (р3<0,05), CD16+ (р3<0,05).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что пептиды печени интактных и опытных баранов способны менять экспрессию CD-маркеров в большей степени на лимфоцитах, выделенных из крови пациентов.

В таблице 2 представлены результаты экспериментов по изучению экспрессии CD-маркеров лимфоцитов, выделенных из крови доноров, при стимуляции цитомединами, полученными из сердца интактных, а также перенесших кровопотерю баранов.

Таблица 2

Изучаемые	Лимфоциты доноров			Лимфоциты больных
показатели (хЮ3кл/мкл)	Физиологический раствор (контроль) п=24	Контрольные пептиды (опыт I) п=24	Опытные пептиды (опыт II) п=24	Физиологический раствор (контроль) п=30	Контрольные пептиды (опыт I) п=30	Опытные пептиды (опыт II) п=30
Т-лимфо-циты CD3+ Pi Р2 Рз	ОДНО,09	0,6±0,05	0,63±0,07	0,63±0,21	0,86±0,39 <0,05	0,92±0,15 <0,05 <0,05
Т-хелперы CD4+ Pi Р2 Рз	0,48±0,04	0,5 НО ,06	0,53±0,05	ОДНО,12	0,54±0,21 <0,05	0,68±0,09 <0,05 <0,05
Т-лимфо-циты CD8+ Pi Р2 Рз	0,33±0,07	0,35±0,04	0,42±0,08 <0,05	0,24±0,06	0,39±0,08 <0,05	0Д9±0,1 <0,05 <0,05
В-лимфо-циты CD22+ Pi Р2 Рз	0,3 НО ,04	0,35±0,04	0,37±0,07	0,26±0,03	0,29±0,06	0,34±0,11 <0,05
NKCD16+ Pi Р2 Рз	ОД НО ,07	0,23±0,04 <0,001	0,52±0,03 <0,05 <0,05	0,23±0,05	0,35±0,12 <0,05	0,49±0,06 <0,05 <0,05

Примечание: условные обозначения те же, что и в таблице 1

Влияние пептидов из сердца животных, полученных до и после кровопотери, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов доноров и больных (M±SD)

Наши наблюдения показали, что выраженного сдвига общего количества Т- и В-лимфоцитов, а также их различных популяций не произошло. Однако зарегистрированы изме нения при инкубации пептидов из сердца баранов до кровопотери с взвесью лимфоцитов здоровых людей. Так, число клеток, несущих маркеры CD16+, уменьшается (р]<0,001) и увеличи- вается при инкубации с пептидами из сердца баранов после кровопотери CD 16+ (р2<0,05; р3<0,05) и CD8+ (р3<0,05).

Далее нами было показано, что инкубация цитомединов из сердца баранов с лимфоцитами больных приводит к выраженным сдвигам в экспрессии CD- маркеров лимфоцитов (табл. 2). Это в полной мере относится к цитомединам, полученным из сердца интактных баранов, которые после инкубации увеличивали маркеры CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ (pi<0,05). Цитомедины, полученные из сердца «опытных» животных еще в большей степени увеличивали содержание маркеров CD3+, CD4+, CD8+ и CD 16+ (р2<0,05; рз<0,05), а также CD22+ (р3<0,05).

Таким образом, полученные данные свиде тельствуют о том, что цитомедины, полученные из печени интактных животных, увеличивают содержание маркеров CD4+ лимфоцитов доноров и повышают количество клеток, несущих маркеры CD3+, CD4+, CD8+ и CD16+, полученных от больных со вторичными иммунодефицитами. Пептиды, выделенные из сердца животных, перенесших кровопотерю, увеличивают число маркеров CD8+ и CD 16+ - лимфоцитов больных ХОБЛ. Проведенное исследование показало, что биологическая активность цитомединов, полученных из печени и сердца животных, перенесших острую кровопотерю, отлична от свойств регуляторных пептидов, полученных от интактных животных.