Биомаркеры алюмотолерантности у зимостойких форм Triticum aestivum L. из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова

Кислые почвы составляют около половины всех посевных угодий мира (1). При этом самые большие площади с избыточной кислотностью почв находятся в России (2-4), что ограничивает производство значимых сельскохозяйственных культур (5-7). Основным эдафическим стрессором кислых дерново-подзолистых почв служат катионы Al3+, или так называемый подвижный алюминий (8, 9). Кислая реакция почвы в присутствии ионов водорода и алюминия приводит к ухудшению ее физических свойств и увеличивает растворимость токсичных соединений (4). При таких усло-

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке проекта Минобрнауки России «Национальная сетевая коллекция генетических ресурсов растений для эффективного научно-технологического развития РФ в сфере генетических технологий» по соглашению ¹ 075-15-2021-1050 от 28.09.2021.

виях макро- и микроэлементы переходят в малодоступную для растений форму (9-15). Основной симптом токсического действия ионов алюминия — ингибирование роста корней, приводящее к нарушению развития растения (6, 9-11).

Площадь сельскохозяйственных угодий с повышенной кислотностью ежегодно растет (1, 5), что обусловлено высокой миграционной способностью ионов алюминия. Это особенно важно для регионов с повышенной влажностью воздуха, где даже при умеренных осадках в почве может скапливаться избыточное количество воды (6, 11). К подобным территориям относится северо-запад Российской Федерации.

Основная часть посевов в России занята под производство озимой и яровой пшеницы (16). H. Raman с соавт. (17) показали, что устойчивые к Al3+ генотипы чаще всего встречаются среди гексаплоидных видов пшениц с геномом D.

В коллекции ФИЦ Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (коллекция ВИР) широко представлены гекса-плоидные виды пшеницы, основная часть которых относится к T. aestivum (44 тыс. образцов). Следует отметить, что отличительная особенность озимой мягкой пшеницы заключается в сочетании устойчивости к низким температурам с хорошими хлебопекарными свойствами муки, чем определяется частое использование этого вида в селекционных программах. Изучение генетического потенциала образцов T. aestivum из коллекции ВИР позволяет выявить среди форм, обладающих другими экономически значимыми признаками, новые источники алюмотолерантности. Такие формы в дальнейшем могут быть использованы в селекции высокопродуктивных сортов T. aestivum с комплексной устойчивостью к стрессовым факторам .

Ионы Al3+ действуют на проницаемость клеточных мембран, влияя на растворимость липидных и протеиновых мембранных комплексов. В результате ингибируется межклеточный транспорт, нарушается работа ионных каналов, вплоть до полной их блокировки (18, 19). Это приводит к нарушению синтеза ДНК и деления клеток, замедлению роста корней и надземных частей растения (20).

Было установлено, что обезвреживание ионов алюминия может происходить либо в апопласте (6, 8, 21-25), куда экскретируются органические кислоты, либо в цитозоле с последующей изоляцией образовавшихся хелатов в вакуоли (6, 8). Поступление органических кислот в межклеточное пространство происходит c участием анионного канала, который активируется воздействием Al³⁺ на TaALMT1 протеин (стимулируемый алюминием переносчик малата у T. aestivum ) (5, 26).

В связывании ионов алюминия участвуют органические кислоты, олигосахара, корневая слизь, действующая как диффузионный барьер (6). В ряде публикаций (6, 26-28) выявлено повышение содержания органических кислот (особенно яблочной и фумаровой), глюкозы, сахарозы и снижение количества фруктозы в корнях алюмоустойчивых образцов кукурузы. Сообщалось о повышенном содержании свободных жирных кислот (в том числе линолевой и линоленовой), флавоноидных гликозидов (рутин, кемп-ферол-3-O-гликозид, лютеолин-6-C-гексозил-гексозид) у алюмоустойчи-вых сортов пшеницы (29).

Таким образом, алюмотолерантность хозяйственно значимых растений остается предметом интенсивного изучения, в том числе сравнения ме-таболомных профилей. Но несмотря на то, что метаболомные исследования ведутся достаточно активно, работ по анализу алюмотолерантности у зимостойких форм, устойчивых к другим абиотическим стрессам, в доступной литературе мы не обнаружили.

В настоящем сообщении впервые приведены данные об особенностях метаболомных профилей у проростков зимостойких образцов T. aestivum с низкой чувствительностью к воздействию ионов алюминия. Выявлены метаболиты — потенциальные маркеры устойчивости к ионам алюминия.

Цель работы — методом неспецифического метаболомного профилирования с применением газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией, выявить биомаркеры алюмоустойчивости у зимостойких образцов T. aestivum .

Методика . В исследовании использовали 20 зимостойких образцов T. aestivum из коллекции ВИР (30-33). Проростки получали из семян (от 16 до 35 шт. каждого образца в каждом варианте опыта) разных лет репродукции (коллекция ВИР) в вегетационном опыте (2019 год) в условиях Пушкинских лабораторий ВИР согласно методике (30).

Лабораторную оценку зародышевых корешков на чувствительность к ионам Al3+ проводили по методу A. Aniol в модификации (33, 34) без добавления эриохромцианинового красителя в среду. Алюмовосприимчивость у образцов определяли на ранних этапах развития растений по отрастанию корней после повреждения (34). Степень чувствительности образцов к токсическому воздействию ионов алюминия определялась по разнице средних значений длин корешков 7-суточных проростков в опыте и контроле. Для измерения визуально отбирали те проростки образца, которые имели наиболее длинные корешки.

Для определения метаболомных профилей (МП) с помощью газожидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией (ГХ-МС), отбирали по пять 7-суточных проростков каждого образца с диной корешка в среднем 2 см. Корешки отделяли с помощью скальпеля, взвешивали, помещали в пластиковые пробирки объемом 2 мл и заливали жидким азотом для разрушения растительных клеток. К пробам добавляли охлажденный метанол (+4 °С) до полного погружения биоматериала в растворитель и инкубировали в течение 24 ч при +4 °С. Полученный экстракт центрифугировали, надосадочную жидкость переносили в стеклянные пробирки для газовой хроматографии, помещали в вакуумный концентратор CentriVap Labconco («Labconco», США) и выпаривали до сухого остатка. Для получения летучих термостабильных триметилсилильных производных к сухому остатку добавляли 20 мкл N,O-бис(триметилсилил)трифторацета-мида с 1 % триметилхлорсиланом и нагревали в течение 15 мин при 100 °С на установке Digi-Block («Laboratory Devices, Inc.», США). В качестве внутреннего стандарта к каждой пробе добавляли 20 мкл раствора трикозана в пиридине (индекс удержания RI = 2288, концентрация 1 мкг/мкл). Для каждой пробы измерения проводили в трех аналитических повторностях. Смесь триметилсилилильных эфиров разделяли с помощью капиллярной колонки Agilent HP-5MS (30 м; 0,25 мм в диаметре; стационарная фаза: 5 % дифенил, 95 % диметилполиоксан с толщиной пленки 0,25 мкм, «Agilent Technologies», США) на газовом хроматографе Agilent 6850A, сопряженном с масс-селек-тивным детектором Agilent 5975 («Agilent Technologies», США), согласно протоколу (35). Начальная температура капиллярной колонки составляла 70 °С, конечная — 320 °С при скорости нагревания: 6 °С/мин. Скорость потока газа-носителя (гелия) соответствовала 1,5 мл/мин. Температура инжектора составляла 300 °С. Объем вводимой пробы 1 мкл, режим ввода пробы — «без сброса». Ионизацию электронным ударом проводили при 70 эВ и температуре источника ионов 230 °С. Запись хроматограммы начинали через 4 мин (время выхода растворителя) и продолжали 62 мин при режиме сканирования ионов от 70 до 600 атомных единиц массы с регистрацией полного ионного тока; скорость сканирования — 2 спектра/с. Метаболиты (триметилсилилильные производные) идентифицировали по масс-спектрам и индексам удерживания Ковача (RI) с использованием программы AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, National Institute of Standards and Technology, USA, Version 2.69, , библиотеки масс-спектров NIST 2010 (National Institute of Standards and Technology, USA, и in-house библиотек Научного парка Санкт-Петербургского университета и Ботанического института РАН им. В.Л. Комарова (27, 36). Индексы удерживания оценивали с помощью калибровки по нормальным алифатическим углеводородам с длиной углеродной цепи С10-С40. Метаболит считали идентифицированным, если коэффициент совпадения (match factor) полученного и библиотечного масс-спектра был более 800. Полуколичественный анализ полученных метаболитных профилей проводили с помощью программы AMDIS по полному ионному току с учетом внутреннего стандарта. Данные представлены в мВ.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Statistica 12 («StatSoft, Inc.», США; 2019) . При оценке роста и развития корешков как показателя чувствительности к хлориду алюминия учитывали минимальные и максимальные значения (min-max), рассчитывали средние (М) и стандартные ошибки средних (±SEM). Достоверность влияния массы корешка проростка и разницы в длине корешка у образца в присутствии и в отсутствие хлорида алюминия в среде (опыт и контроль) на распределение образцов T. aestivum по чувствительности к ионам алюминия оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием F-критерия Фишера. Для выявления компонентов, достоверно дифференцирующих образцы T. aestivum на группы с разной степенью алюмотолерантности, использовали классический дискриминантный анализ с последующим каноническим корреляционным анализом. Информационно значимыми считали метаболиты, для которых была достоверно установлена принадлежность образцов к группе восприимчивых или чувствительных к ионам алюминия, что подтверждалось F-критерием Фишера (р не менее 0,05).

Результаты . Из коллекции ВИР мы отобрали для изучения следующие образцы T. aestivum (табл. 1):

1. Зимостойкие образцы Triticum aestivum из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР) , отобранные для исследования (2019 год)

¹ в каталоге ВИР	1          Сорт	1     Происхождение	^ Год репродукции
к-29466	РПГ 27/36	Россия, Саратовская область	2019
к-32715	Без названия	Россия, Владимирская область	2019
к-45885	Мироновская юбилейная	Украина (до 1991 года)	2019
к-57573	Белоснежная	Россия, Ростовская область	2019
к-58321	Стремнина	Россия, Самарская область	2019
к-59261	Северная заря	Россия, Омская область	2019
к-59269	Немчиновская 52	Россия, Московская область	2019
к-62431	Казанская 84	Россия, Республика Татарстан	2019
к-63040	Зимородок	Россия, Краснодарский край	2019
к-63353	Majoral	Франция	2019
к-63401	Руфа	Россия, Краснодарский край	2019
к-63521	Agassir	США	2019
к-63523	Vista	США	2019
к-63562	S89-142	Канада	2019
к-63568	Родник тарасовский	Россия, Ростовская область	2019
к-63930	Арфа	Россия, Ростовская область	2019
к-64032	Fazit	Германия	2019

Продолжение таблицы 1

к-64163       CDC Harrier к-64180       Fatima к-64278       Безенчукская 616

Канада2019

Венгрия2019

Россия, Самарская область2019

Это зимостойкие образцы, которые выделили в результате полевых испытаний, проведенных в период с 2007 по 2019 год в Северо-Западном регионе РФ (г. Пушкин, Ленинградская обл., N59 ° 41‘ E30 ° 20‘) (31, 32). Степень зимостойкости определяли по изреженности всходов на делянках в октябре перед уходом в зиму и в апреле после зимовки с использованием шкалы, разработанной в ВИР (30). Полная гибель растений оценивалась как 0 баллов, очень низкая зимостойкость (сохранилось < 30 % всходов) — 1 балл, низкая зимостойкость (31-50 %) — 3 балла, средняя (51-70 %) — 5 баллов, высокая (71-90 %) — 7 баллов и очень высокая (> 90 %) — 9 баллов (21). Зимостойкими считались образцы, оценка которых была выше 7 баллов (32). В опыт мы брали образцы со средней, высокой и очень высокой степенью зимостойкости.

К наиболее показательным признакам токсического действия ионов алюминия на проростки T. aestivum относят длину и массу корней (9, 23). По чувствительности корешков проростков T. aestivum к ионам алюминия образцы в нашем опыте разделились на три группы (табл. 2). Первая группу включала 2 образца с наименьшей разницей между опытом и контролем по длине корешков (2,2-3,0 см) и низкой чувствительностью к Al³⁺, вторая — 13 образцов со средней величиной разницы (3,1-3,9 см) и средней чувствительностью к Al³⁺, третья — 5 образцов с максимальной разницей (4,04,5 см) и высокой чувствительностью к Al³⁺.

2. Распределение изученных зимостойких образцов Triticum aestivum (коллекция ВИР) по длине корешков у 7-суточных проростков и массе корешков в присутствии Al³⁺ (лабораторный опыт, 2022 год)

¹ в каталоге ВИР	Группа	n	Длина корешков, см; min-max, M ±SEM			Масса корешков, г (опыт)
			контроль	опыт	разница
57573	1-я	24	2,2-8,3 5,9±0,4	2,0-5,7 3,6±0,2	2,3	0,109
63523	1-я	27	2,4-7,0 5,3±0,5	1,2-4,4 2,8±0,3	2,5	0,133
29466	2-я	30	7,2-10,2 8,8±0,2	3,4-6,8 5,1±0,1	3,7	0,131
32715	2-я	30	6,7-10,5 8,0±0,2	3,6-5,5 4,3±0,1	3,8	0,118
45885	2-я	27	3,7-9,2 7,0±0,3	2,2-5,4 3,6±0,1	3,4	0,140
58321	2-я	24	6,7-10,8 8,4±0,2	2,5-6,9 5,0±0,2	3,4	0,106
59261	2-я	32	6,7-10,0 8,4±0,2	3,0-6,1 4,8±0,2	3,6	0,102
59269	2-я	24	3,7-9,3 7,4±0,4	2,1-5,2 3,6±0,2	3,8	0,139
63040	2 я	28	5,1-10,0 8,1±0,3	3,2-5,8 4,5±0,1	3,5	0,151
63401	2 я	30	4,5-9,0 7,7±0,2	3,1-10,0 4,3±0,3	3,4	0,153
63521	2 я	29	3,7-9,3 7,4±0,4	2,1-5,2 3,6±0,2	3,8	0,154
63568	2 я	27	4,4-8,2 7,0±0,3	2,1-5,2 3,4±0,1	3,7	0,144
63930	2 я	28	6,3-15,2 9,2±0,5	4,0-7,3 5,8±0,2	3,5	0,156
64032	2 я	16	5,0-11,5 8,7±0,3	3,0-8,3 5,6±0,3	3,1	0,076
64163	2 я	29	5,0-9,3 7,7±0,2	3,0-8,3 4,3±0,2	3,4	0,123
64180	3 я	30	6,6-11,0 8,4±0,2	2,7-5,5 3,9±0,1	4,5	0,234

Продолжение таблицы 2

Рис. 1. Дисперсионный анализ разницы в длине корешка у 7-суточных зимостойких проростков Triticum aestivum (коллекция ВИР) в присутствии и в отсутствие Al³⁺ (соответственно опыт и контроль) (А) и массы корешков (Б) (лабораторный опыт, 2022 год). Размеры выборок соответствуют указанным в таблице 2.

64278	3 я	28	6,9-11,2 9,2±0,2	2,5-7,5 4,7±0,2	4,5	0,190
62431	3 я	20	4,4-9,0 7,3±0,2	1,0-4,2 3,3±0,2	4,1	0,121
63353	3 я	29	5,0-11,1 8,7±0,3	2,8-6,3 4,6±0,2	4,2	0,165
63562	3 я	25	5,5-9,5 8,0±0,2	2,2-4,5 3,7±0,1	4,3	0,160

Пр и меч ани е. Образцы T. aestivum разделены на группы по чувствительности к AlCl 3 на основании различий по длине корешка проростков как показателя чувствительности к хлориду алюминия; 1-я группа — образцы с низкой чувствительностью; 2-я группа — образцы со средней чувствительностью, 3-я группа — образцы с высокой чувствительностью к воздействию Al³⁺. Указана масса корешков (по 5 на образец в опыте), взятых для экстракции.

Достоверность влияния параметров, приведенных в таблице 2, на распределение образцов T. aestivum в соответствии с чувствительностью к ионам алюминия проверили с помощью дисперсионного анализа (рис. 1, А, Б). Оказалось, что на распределение образцов T. aestivum по группам устойчивости к Al³⁺ достоверно влияет только разница длин корешков между опытом и контролем (см. рис. 1, А, F = 68,68; p = 0,05); влияние массы корешков было недостоверным (см. рис. 1, Б, F = 0,17; p = 0,847). Следует, однако учитывать, что при увеличении размера анализируемой выборки T. aestivum достоверность влияния фактора «группа устойчивости» на массу корешка у проростков, как и влияние массы корешка на распределение образцов по группам устойчивости могут быть выше.

По результатам неспецифического метаболомного профилирования у образцов из разных групп устойчивости к Al3+ мы выявили в МП около 500 пиков. Почти 250 веществ было идентифицировано до класса, 120 — до конечного соединения (табл. 1 Приложения, см. . Идентифицированные вещества были разделены на 19 основных групп (см. табл. 1 Приложения, см. : 33 кислоты, 13 полиолов и их производных, 2 пиридина, 22 свободные жирные кислоты и их производные, 2 моноацилглицерола, 12 свободных аминокислот, циклический амид (2-пирролидинон), 7 метиловых производных моносахаров, 38 моносахаров (триоза, пентозы, гексозы), 90 олигосахаров, 10 фенолсодержащих соединений, 2 терпена, 11 фитостеролов, амиды и амины (дециламин, карбамид), 4 лактонные формы органических кислот, 6 производных органических кислот и фосфорной кислоты, куда вошли эфиры органических и эфиры фосфорной кислот, 2 алкана, 3 нуклеозида и неидентифицированные компоненты.

Рис. 2. Основные соединения, выявленные в метаболомных профилях корешков у 7-суточных зимостойких проростков Triticum aestivum (коллекция ВИР) из групп с разной чувствительностью к ионам алюминия : А — пиридины (а), циклический амид (б), алканы (в), триозы (г), терпены (д), амины и амиды (е); Б — лактоны (а), производные (эфиры органических кислот и фосфорной кислоты) (б), моноацилглицеролы (г), пентозы (д), фенолсодержащие соединения (е); В — полиолы и их производные (а), свободные жирные кислоты и их производные (б), нуклеозиды (в), свободные аминокислоты (г), производные моносахаров (д), фитостеролы (е); Г — органические кислоты (а), гексозы (б), олигосахара (в), неидентифицированные компоненты (г) (газовый хроматограф Agilent 6850A, сопряженный с масс-селективным детектором Agilent 5975, «Agilent Technologies», США; 2022 год). Приведены результаты в расчете на массу пяти корешков для каждого образца с усреднением по группе. Размеры выборок соответствуют указанным в таблице 1. Измерения выполнены в 3 аналитических повторностях.

В МП образцов с низкой чувствительностью к ионам алюминия доминировали полиолы, нуклеозиды, лактонные формы органических кислот, свободные жирные кислоты и их производные, моносахара, олигосахара, фенолсодержащие вещества, терпены, фитостеролы; с высокой чувствительностью — органические кислоты, пиридины, моноацилглицеролы, свободные аминокислоты, производные моносахаров. МП образцов со средней чувствительностью к Al³⁺ не имели выраженных особенностей (рис. 2, А-Г). Метиловые эфиры органических кислот, эфиры фосфорной кислоты и алканы были в равной степени представлены у всех групп образцов T. aestivum .

Несмотря на отмеченные различия, МП образцов с разной устойчивостью к ионам алюминия были в целом сходны. Явным исключением оказалась группа лактонов. Для МП образцов со средней и низкой устойчивостью к Al3+ была характерна более выраженная представленность лактона арабиновой кислоты (RI = 1657) и 1,5-лактона глюконовой кислоты (RI = 1696), тогда как для МП образцов с высокой устойчивостью к Al3+ — только лактона арабиновой кислоты (RI = 1657). Можно предположить, что лактоны сахарных кислот участвуют в защите растения от Al3+, которую чаще всего связывают с образованием хелатных комплексов (6, 8) между ионами алюминия и органическими кислотами, в нашем наблюдении — с лактонными формами сахарных кислот. Кроме того, наличие этих соединений может быть сопряжено с более интенсивным образованием (под воздействием стрессора) корневой слизи, в состав которой они могут входить (6, 8, 21-24).

Дисперсионный анализ всей совокупности метаболитов, кроме не-идентифицированных, показал, что у проростков с более выраженной устойчивостью к Al3+ (1-я группа) МП корешков достоверно отличается от МП других групп значениями для янтарной, каприловой, стеариновой, олеиновой, линолевой кислот, метиловых эфиров фосфорной кислоты, этиловых эфиров пальмитиновой и линоленовой кислот, у образцов со средней чувствительностью (2-я группа) — значениями для ряда олигосахаров (RI = 2730, RI = 294, RI = 3625, RI = 3189). У образцов, чувствительных к воздействию ионов алюминия (3-я группа), мы не выявили достоверных особенностей МП. Однако, учитывая различия, близкие к достоверным (0,1 > ρ > 0,05), можно отметить, что для МП образцов из 3-й группы были характерны более выраженные изменения по сумме терпенов, в том числе люпеола (табл. 2 Приложения, .

У устойчивых образцов увеличение концентрации янтарной и фосфорной кислот в МП может быть связано с их накоплением для нейтрализации Al³⁺. Есть мнение, что помимо органических кислот в связывании ионов алюминия участвует корневая слизь, выделяемая внешними слоями корневого чехлика (6). С действием этого механизма защиты, возможно, связаны изменения в составе олигосахаров у образцов T. aestivum со средней чувствительностью к Al³⁺. Олигосахара могут входить в состав корневой слизи, действующей как диффузионный барьер, ограничивая попадание Al³⁺ внутрь клеток корня растения (6). Кроме того, олигосахара накапливаются в результате разрушения клеточных стенок гидролазами в ответ на действия стрессора (37). Люпеол, как и другие терпеноиды, тоже служит фактором защиты растений от солевого стресса (38), поэтому можно предположить, что установленное нами накопление терпенов в корешках проростков T. aestivum , чувствительных к воздействию ионов алюминия, инициируется воздействием стрессора.

Таким образом, под влиянием ионов алюминия у проростков T. aestivum наблюдаются изменения карбогидратного, энергетического, липидного обмена и биосинтеза вторичных метаболитов. Синтез как некоторых органических кислот, так и всего их пула может быть вызван контактом со стрессором (ионами алюминия) и активацией механизма нейтрализации ионов посредством образования хелатов (5, 6, 8, 26, 39). Накопление свободных жирных кислот и их эфиров также является ответной реакцией на стресс и может отражать изменения в мембранном комплексе (глицероли-пидах, триглицеридах), активизацию синтеза антистрессовых растительных гормонов (жасмоновая кислота, нитроалкены), предшественниками которых они являются (40-43). Суммируя, можно предположить, что в нашем исследовании ионы алюминия оказали наиболее существенное влияние на цикл Кребса, синтез карбогидратов, растительных гормонов, других защитных факторов, глицеролипидов и триглицеридов мембранного комплекса.

Классический дискриминантный анализ с последующим каноническим анализом позволил выделить 11 компонентов, со 100 % достоверностью разделяющих образцы T. aestivum с разной степенью алюмотолерантности

(табл. 3 Приложения, . Это фосфорная, яблочная, 2-деоксирибоновая, янтарная, каприловая кислоты, четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты, метиловые эфиры олеиновой, линолевой кислот, моноацилглицерол [16:0/0:0/0:0], олигосахар (RI = 2749), Из перечисленных веществ наиболее информационно значимыми (p < 0,05) оказались фосфорная, яблочная, янтарная кислоты, четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты, метиловый эфир линолевой кислоты.

1-я группа

2-я группа

3-я ip'.nii.i

Рис. 3. Распределение 15 образцов Triticum aestivum (коллекция ВИР) из групп с разной чувствительностью к ионам алюминия в пространстве канонических осей: 1-я группа — с высокой алюмотолерантностью, 2-я группа — со средней, 3-я группа — с низкой алюмотолерантностью; 1 — к-45885, 2 — к-64032, 3 — к-64163, 4 — к-59261, 5 — к-32715, 6 — к-59269, 7 — к-63568, 8 — к-63930, 9 — к-63401, 10 — к-29466, 11 — к-62431, 12 — к-61180, 13 — к-63562, 14 — к-62521, 15 — к-64278 (лабораторный опыт, 2022 год). Анализ выполнен по результатам метаболомного профилирования, см. рис. 2, табл. 4 Приложения).

На рисунке 3 представлено распределение образцов T. aestivum с разной чувствительностью к ионам алюминия (1-3-я группы) в пространстве канонических осей. В качестве переменных выступают канонические функции (ось 1 и ось 2, табл. 4 Приложения, по 11 показателям, вошедшим в модель в процессе классического пошагового дискриминантного анализа. По канонической оси 1 (или Root 1), охватывающей 86,5 % дисперсии, 2-я группа образцов (со средним уровнем алюмоустойчивости) обособляется от 1-й и 3-й групп. По оси 2 (или Root 2, 13,5 % дисперсии) разделяются 1-я и 3-я группы анализируемых образцов. При этом 1-я и 3-я группы образуют компактные кластеры в отличие от 2-й группы. Наиболее значимыми дискриминирующими факторами оказались шесть метаболитов: фосфорная, яблочная, янтарная кислоты, четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты и метиловый эфир линолевой кислоты (табл. 3 Приложения, , они достоверно (p < 0,05) характеризуют устойчивые к ионам алюминия формы T. aestivum, изученные нами в настоящей работе, и являются статистически подтвержденными маркерами алюмоустойчивости.

Обсуждая полученные нами результаты, следует отметить, что мета-боломные исследования хозяйственно значимых растений с разной степенью устойчивости к ионам алюминия и работы по выявлению маркеров алюмотолерантности немногочисленны, хотя алюмотолерантность остается предметом интенсивного изучения.

Сообщалось (6, 27, 28), что содержание органических кислот (особенно яблочной и фумаровой), глюкозы, сахарозы повышалось, а количества фруктозы снижалось в корнях алюмоустойчивых образцов кукурузы. У изученных нами алюмотолерантных образцов T. aestivum МП отличался от остальных МП по количественным показателям янтарной и каприловой кислот, метиловых эфиров фосфорной кислоты и эфиров свободных жирных кислот, в числе которых есть и предшественники растительных гормонов (40-42). Яблочная кислота не вошла в перечень достоверных признаков, отличающих устойчивые к ионам алюминия формы T. aestivum от неустойчивых, хотя выделение преимущественно этой кислоты — особенность защитной реакции пшеницы в ответ на контакт с Al³⁺ (26, 37, 44). Поэтому яблочную кислоту все же можно рассматривать в качестве метаболита, маркирующего алюмоустойчивость проростков T. aestivum . Олигосахара оказались характерными для МП образцов со средним уровнем устойчивости к ионам алюминия. То есть при воздействии ионов алюминия изменяется накопление карбогидратов, синтез и транспорт веществ-антистрессоров, энергетический обмен, метаболизм крахмала и сахарозы (27), что в целом соответствует нашим данным. В работах по изучению механизмов алюмоустойчивости отмечается разная активность органических кислот при связывании ионов алюминия: малоновая кислота относится к группе со средней активностью, янтарная и молочная кислоты — к группе с низкой активностью (4). Согласно полученными нами данным, у проростков T. aestivum основной кислотой, способной нейтрализовать Al³⁺, оказалась янтарная, которую на этом основании мы отнесли к группе со средней активностью связывания ионов алюминия. Тем не менее мы можем предположить, что в защите от этого стрессора участвуют и другие кислоты, которых нет среди перечисленных. Так, мы установили, что в МП устойчивых форм T. aestivum были в большей степени представлены органические кислоты в целом, а также лактонные формы сахарных кислот. Наше предположение согласуется с результатами других исследований (2, 3, 6, 8). Авторы указывают на широкий спектр кислот, участвующих в защите растений от токсического действия Al³⁺ (13, 15, 4 5). Согласно опубликованным данным (4, 15, 46), аминокислоты и фенольные соединения подобно органическим кислотам способны образовывать с ионами Al³⁺ не опасные для растения хелатные формы. Количество таких веществ имеет тенденцию к увеличению после воздействия стрессора (19), что подтверждают результаты нашего исследования. Как уже отмечалось, фенолсодержащие соединения преобладали в МП устойчивых форм T. aestivum , свободные аминокислоты — в МП неустойчивых форм . Более интенсивное накопление фосфорной кислоты и метилфосфата в корешках проростков, которое мы наблюдали у образцов, чувствительных к Al³⁺, также связано с механизмом инактивации ионов алюминия (3, 29).

Выявленное нами увеличение доли нуклеозидов, в частности аденозина, в МП алюмоустойчивых форм может быть вызвано усилением активности S-аденозилметионин-синтетазы, которое связано с изменениями клеточной стенки под воздействием Al³⁺, о чем сообщали M.W. Oh с соавт. (37). Отмеченное нами уменьшение количества нуклеозидов у неустойчивых к Al³⁺ форм T. aestivum соответствует механизмам алюмотолерантности, рассмотренным в обзоре Н.В. Амосовой с соавт. (15).

A.L. Garcia-Oliveira с соавт. (6) обнаружили связь между количеством корневой слизи и устойчивостью пшеницы к Al3+. R.K. Sairam с соавт. (47) среди соединений, обеспечивающих стабилизацию макромолекул раститель- ных клеток при абиотическом стрессе, указывают простые сахара (фруктоза и глюкоза), полиолы (глицерол, маннитол, сорбитол, метилированные инозиты, миоинозитол, ононитол), олигосахара (трегалоза, раффиноза, сахароза и фруктаны), пролин, аскорбиновую кислоту. В нашем исследовании особенностью МП образцов T. aestivum со средней устойчивостью к ионам алюминия было повышенное содержание некоторых олигосахаров, которые могут входить в состав слизи, защищающей корешки проростков. Кроме этого, к маркерам алюмоустойчивости мы отнесли четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты, усиление синтеза которых, скорее всего, связано с действием стрессора, что также согласуется с приведенными выше данными литературы.

В работе M.D. Mashabela с соавт. (29) показано, что для алюмоустой-чивых сортов пшеницы характерно более высокое содержание свободных жирных кислот (в том числе линолевой и линоленовой), флавоноидных гликозидов (рутин, кемпферол-3-O-гликозид, лютеолин-6-C-гексозил-гек-созид), а для восприимчивых — оксикоричных кислот. Участие вторичных метаболитов в защите растения от Al³⁺ подтверждается и в ряде других работ (6, 48-50). В МП изученных нами образцов T. aestivum , устойчивых к Al³⁺, также увеличивалось количество свободных жирных кислот с преобладанием линолевой и фенолсодержащих соединений с доминированием хинной и сирингиновой кислот. Флавоноидные гликозиды у устойчивых к Al³⁺ образцов T. aestivum были представлены арбутином, а фенолсодержащие соединения восприимчивых образцов — преимущественно хинной кислотой и арбутином. При негативном воздействии ионов алюминия на ткани растения синтез ненасыщенных жирных кислот активируется. Они участвуют в поддержании структуры клеточной мембраны и служат предшественниками при синтезе гормонов стресса — жасмонатов (39-41, 51). Как уже отмечалось, в МП устойчивых форм T. aestivum было выше содержание свободных жирных кислот и их производных, а повышение содержания метиловых и этиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть предшественниками гормонов стресса, по нашим данным, служит достоверным биохимическим признаком изученных зимостойких алюмоустойчивых образцов T. aestivum .

Более интенсивное накопление фосфорной кислоты и метилфосфата мы наблюдали у образцов T. aestivum, чувствительных к Al³⁺, что, видимо, также связано с механизмом инактивации ионов (3, 29). Отмечено (51), что воздействие ионов алюминия влияет на основные обменные процессы: цикл трикарбоновых кислот, гликолиз и на активность образования вторичных метаболитов, что согласуется с полученными нами данными.

Одной из задач нашего исследования было определение метаболитов — маркеров устойчивости образцов T. aestivum к воздействию Al³⁺. В работе M.D. Mashabela с соавт. (29) маркерами алюмоустойчивых форм T. aestivum названы хинная, линоленовая, 9,12,13-тригидрокси-10,15-окта-диеновая кислоты, валин, флавон изоориентин. Это не совпадает с полученными нами результатами. На основе неспецифического метаболомного профилирования мы выделяем в качестве маркеров алюмотолерантности проростков T. aestivum фосфорную, яблочную, янтарную кислоты, четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты и метиловый эфир линолевой кислоты.

Выделившиеся в нашем исследовании образцы T. aestivum могут стать исходным материалом при селекции как пшеницы, так и устойчивых сортов тритикале (26).

Таким образом, полученные нами результаты и данные других ис- следований в основном согласуются. Имеющиеся расхождения связаны, скорее всего, со свойствами биоматериала, взятого для изучения, и спецификой методик, выбранных для проведения анализа.

Итак, мы выявили особенности метаболомных профилей (МП) у зимостойких образцов Triticum aestivum с разной степенью восприимчивости к ионам алюминия и подтвердили влияние Al³⁺ на процессы как первичного (цикл Кребса, синтез карбогидратов, глицеролипидов и триглицеридов мембранного комплекса), так и вторичного метаболизма (синтез растительных гормонов и других защитных факторов — гликозидов, терпенов). При анализе МП установлены метаболиты, с высокой степенью достоверности (p < 0,05) отличающие алюмотолерантные образцы T. aestivum от чувствительных. Это фосфорная, яблочная, янтарная кислоты, четырехатомный (RI = 1537) и пятиатомный (RI = 1735) спирты и метиловый эфир линолевой кислоты, содержание которых изменяется под воздействием ионов алюминия. Перечисленные соединения могут быть использованы как биохимические маркеры устойчивости озимой мягкой пшеницы к Al³⁺ при поиске алюмотолерантных форм и селекции высокопродуктивных и адаптированных к условиям северо-запада России сортов T. aestivum с комплексной устойчивостью к стрессовым факторам. Кроме того, выделившиеся образцы T. aestivum могут стать одной из родительских форм при селекции устойчивых сортов тритикале.