Биопленка - как форма существования микроорганизмов

MICROBIAL BIOFILM – AS A FORM OF THE EXISTENCE OF MICROORGANISMS

R.A. Baymatov, Z.A. Nuruzova, Z.N. Ergasheva

Актуальность. Многоклеточное поведение бактерий привлекает большое внимание исследователей во всем мире. Наиболее хорошо изучено связанное с субстратом сообщество микроорганизмов, состоящее из одного или нескольких видов – биопленка. Согласно современным представлениям, биопленка — это совокупность микроорганизмов, в составе которой бактерии взаимодействуют друг с другом, что способствует повышению их устойчивости к факторам внешней среды и понижению эффективности антибактериальной терапии. Биопленка состоит из непрерывного мультислоя бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и к друг другу и заключенных в биополимерный матрикс [9]. По данным электронного ресурса PUBMED, за последние годы опубликовано более 5000 работ по биопленкам [12], из них около 1000 работ посвящены биопленкам, образуемым микроорганизмами на поверхности катетеров, что свидетельствует о высоком интересе медицинского сообщества к этому вопросу [5]. Изучение биопленок вызывает большой интерес исследователей в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в области медицины. По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США), до 80% бактериальных инфекций, поражающих людей в западных странах вызваны полимикробными биопленками. Многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования — линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, -обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств. Будучи заключенными в матрикс биопленки, состоящей из полипептидов, микроорганизмы проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков и антисептиков [14]. По этой причине ведутся непрерывные поиски средств, способных губительно воздействовать на биопленки и патогенные микроорганизмы, заключенные в ней [8].

Трудности лечения многих бактериальных инфекций связаны с формированием в организме больного микробных биоплёнок. В составе биопленки микробы обладают повышенной устойчивостью к эффекторам иммунной системы, антибиотикам и дезинфектантам [2]. Биоплёночные бактерии способны выживать при воздействии антибиотиков в таких высоких концентрациях, которые не могут быть достигнуты в организме человека при стандартных терапевтических дозировках. Более того, например, известен парадоксальный факт усиления биоплёночного роста Staphylococcus capitis в присутствии максимальных терапевтических концентраций оксациллина [20]. Еще одна негативная характеристика биоплёнок заключается в том, что они, как правило, проявляют устойчивость одновременно ко многим антибиотикам из разных групп. В клинических условиях столь высокая выживаемость биоплёночных микробов ведёт к хронизации инфекционного процесса множественная резистентность может быть связана с фильтрующей способностью матрикса. Наблюдения in vitro показали, что матрикс бактериальных биоплёнок состоит из различных биополимеров – полисахаридов, белков и даже ДНК [11]. Матрикс не только связывает клетки в единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, образуя трехмерную фильтрующую систему. Это позволило назвать биоплёнку «молекулярным фильтром» и считать фильтрацию одной из важнейших функций биоплёнки [4]. Биопленки также обнаруживают в ранах, и предполагается, что они в некоторых случаях замедляют процесс заживления. Электронная микроскопия показала, что 60% биоптатов, взятых из хронических ран, содержали биопленки, в то время как образцы из свежих – лишь 6%. В связи с этим считают, что биопленки являются основным фактором, способствующим возрастанию числа хронических воспалительных заболеваний. При этом предполагают наличие биопленок в большинстве хронических ран, по крайней мере, на части раневого ложа.

Формирования биопленок. Сами бактерии составляют 535% массы биопленки, остальная часть - межклеточный матрикс. Некоторые бактерии (чаще кокки) могут образовывать более простые по сравнению с биопленкой надклеточные структуры — кластеры. Иногда в качестве синонимов термина «кластеры» употребляются слова «агрегаты», «конгломераты». Наиболее известным кластером является скопление стафилококков, похожее, по определению основоположников микробиологии, на гроздь винограда [15]. Этапы формирования биопленки. Этап 1. Обратимое прикрепление к поверхности. Чаще всего микроорганизмы существуют в виде свободно плавающих масс или единичных (например, планктонных) колоний. Однако в нормальных условиях большинство микроорганизмов стремятся прикрепиться к поверхности и, в конечном счете, образовать биопленку. Этап 2. Перманентное прилипание к поверхности. По мере размножения бактерий они более прочно прилипают к поверхности, дифференцируются, обмениваются генами, что обеспечивает их выживаемость. Этап 3. Формирование слизистого защитного матрикса/биопленки. Благодаря исследованиям ученного Cencetti C. известно, что однажды устойчиво присоединившись, бактерии начинают образовывать экзополисахаридный окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular polymeric substance). Это предохранительный матрикс или «слизь» (EPS-matrix). Мелкие колонии бактерий затем образуют первоначальную биопленку [16]. Cостав матричной слизи варьирует в соответствии с тем, какие именно микроорганизмы в нем присутствуют, но в основном в него входят полисахариды, белки, гликолипиды и бактериальная ДНК [16]. Cencetti C. утверждает, что разнообразные протеины и энзимы способствуют более прочному прилипанию биопленок к раневому ложу. Русские ученные Плакунов В. К., Мартьянов С. В. Определили, что время образования биопленок варьируется, их экспериментальные лабораторные исследования показали, что планктонные бактерии, например стафилококки, стрептококки, псевдомонады, кишечная палочка обычно: 1) присоединяются друг к другу в течение нескольких минут; 2) образуют прочно присоединенные микроколонии в течение 2–4 часов; 3) вырабатывают внеклеточные полисахариды и становятся значительно более толерантными к биоцидам, например, к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, в течение 6–12 часов; 4) вовлекаются в полноценные колонии биопленки, которые очень устойчивы к биоцидам и теряют планктонные бактерии в течение 2–4 дней в зависимости от видов бактерий и условий роста; 5) быстро восстанавливаются после механического разрушения и вновь формируют зрелую биопленку в течение 24 часов [7, 19]. Эти факты позволяют предположить, что, например, проведение нескольких последовательных очищений раны может дать небольшой промежуток времени, например, менее 24 часов, в течение которого антимикробное лечение наиболее эффективно в отношении как планктонных микроорганизмов, так и внутрибиопленочных клеток возбудителя в ране. Биопленки – это микроскопические структуры. Однако в некоторых ситуациях, когда им дают возможность расти беспрепятственно в течение продолжительного периода времени, они становятся настолько плотными, что их можно увидеть невооруженным глазом. Например, зубной налет может накапливаться и становиться четко видимым в течение дня. Некоторые бактерии из фенотипа продуцируют пигменты, что может способствовать визуальной детекции всей биопленки. В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия, например, конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование.

Биопленки существенно повышают толерантность микроорганизмов, внедренных в ее матрикс, к иммунной системе хозяина, антимикробным агентам и стрессам окружающей среды (например, ограничения в кислороде и питании). Эта толерантность может способствовать полной резистентности к факторам, которые могли бы легко уничтожить этих же самых микробов в случае их роста в незащищенном, планктонном состоянии. В исследованиях Романова Ю.М. показано, что наиболее низкие концентрации, требуемые для уничтожения или удаления бактериальной биопленки, для большинства антибиотиков фактически превышают максимальные прописываемые врачами дозы. Таким образом, стандартные пероральные дозировки для тех антибиотиков, которые эффективно уничтожают обычно чувствительные планктонно-выращиваемые в клинической лаборатории бактерии, могут иметь слабое антимикробное действие или могут быть вовсе неэффективными в отношении того же типа бактерий в биопленках, выделенных из ран пациентов. Даже если существует большая вероятность того, что в ране имеется биопленка, отсутствует одношаговое средство лечения. Оптимальным может быть использование комбинированной стратегии, основанной на элементах подготовки раневого ложа и служащей для снятия массы биопленки, предотвращения реконструкции биопленки. Этот подход иногда называют «biofilm-based wound care» (лечение ран с биопленкой). Внеклеточный матрикс и его компоненты выступают в качестве барьера, уменьшающего концентрацию средства непосредственно возле бактерии. Поэтому особую актуальность на сегодняшний день представляет поиск антимикробных агентов, влияющих на жизнеспособность микроорганизмов в культуре и биопленках. При этом принципиально новым направлением выступает использование наночастиц металлов для придания специфических свойств модифицированным ими материалам [20].

Кроме основных адгезионных компонентов, ученным Овчинниковым Р.С. было определено что, многие бактерии образуют на поверхности клеток нитевидные структуры, известные как “курли” (curli), формируемые амилоидными белками. У кишечных бактерий эти белки могут составлять значительную часть биопленочного протеома. Они играют важную роль в адгезии, формировании структуры биопленок и взаимодействии бактерий с иммунной системой хозяина [6]. Выявить их наличие можно, например, наблюдая эффект двойного лучепреломления комплекса таких белков с красителем конго рот [19]. Для достижения эффективности антибактериального или противомикробного препарата в биопленке (применяемого как местно, так и системно) может потребоваться значительное увеличение концентрации препарата. Рыбальченко О.В. подсчитал что, время проникновения ципрофлоксацина внутрь биопленки Pseudomonas aerogenosa увеличивается в 30 раз по сравнению со временем, требуемым для проникновения препарата внутрь одиночной клетки, а устойчивость к антимикробным препаратам возрастает в 50-1000 раз по сравнению со свободными и «флоттирующими» микроорганизмами. Именно в виде биопленки бактерии существуют во внешней среде и колонизируют организмы, в том числе организм человека. Микробные биопленки играют ведущую роль в хронизации инфекционных заболеваний. Большую обеспокоенность вызывает инфицирование медицинских имплантов, таких как катетеры, сердечные клапаны и суставные протезы. На фоне высокой антибиотикорезистентности многих патогенных и условнопатогенных бактерий, клетки в составе биопленки на несколько порядков более устойчивы к действию антибиотиков и дезинфектантов, что делает их практически неуязвимыми. С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что, биопленки, независимо от состава, обладают универсальной, сложной, с некоторыми незначительными вариациями, гетероцитоархитектоникой (трехмерные грибовидные или похожие на колонны), представляя собой микроколонии, заключенные в экзополимерный матрикс и окруженные наполненными жидкостью каналами. Первый механизм может быть обусловлен существованием в биопленках особых персистирующих форм бактерий – персистеров. Персистеры – фенотипический вариант клеток с обычными для данного штамма генотипом, но сильно заторможенным метаболизмом. В результате действия белков-персистеров блокируется функциональная активность всех мишеней антибиотиков, что опосредует формирование мультитолерантности. Поэтому бактерицидные антибиотики в отношении персистеров способны оказывать только бактериостатический эффект.

Энзибиотики. Одним из важнейших механизмов является образование микробных ферментов, способных непосредственно разрушать антибиотики. Среди возбудителей растет устойчивость к пенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам, По мнению таких исследователей, как Овчинников Р.С., Харсеева Г.Г., Миронов А.Ю., Фролова Я.Н. прийти на смену антибиотикам могут т.н. энзибиотики – препараты, в корне отличающиеся от антибиотиков по механизму действия. По своей природе они являются ферментами, способными непосредственно лизировать те или иные структуры микробной клетки. Колоссальным преимуществом энзибиотиков является то, что они с успехом лизируют микроорганизмы любого типа резистентности, в т.ч. и госпитальные штаммы, и при этом не проявляют таких побочных эффектов на макроорганизм, как многие антибиотики. Разработкой энзибиотиков сейчас активно занимаются многие научные лаборатории во всем мире. Отдельные препараты этой группы уже выпущены на рынок некоторых стран. Например, дисперсин – энзибиотик, действующий целенаправленно на биопленки. Он лизирует цементирующее вещество биопленочного матрикса поли– N– ацетил–глюкозамин. Еще одним перспективным энзибиотиком является лизостафин, действие которого специфически направлено против Staphylococcus aureus - важнейшего возбудителя инфекций, в т.ч. и внутрибольничных. [6].

Выводы: Таким образом на сегодняшний день суть биопленок изучена еще не в полном объеме, следовательно, тема остается еще актуальной. Нашей целью является изучение биопленок резистентных штаммов микроорганизмов, которые распространены в Республике Узбекистан.