Биоповреждения горюче-смазочных материалов в условиях северных регионов

[1, 3, 4]. В топливах, поврежденных микроорганизмами, образуется осадок или слизь, изменяются кислотность и другие показатели. Смазочные масла, жировые эмульсии приобретают не свойственный им запах, наблюдается снижение их вязкости, повышение кислотного числа, отмечаются случаи вспучивания и расслоения эмульсий. Однако наличие микроорганизмов в топливе не означает, что оно обязательно повреждено, так как его основные физико– химические показатели при этом, как правило, не изменяются [5, 6].

Цель работы – обнаружение микроорганизмов, повреждающих топлива, и изучение их способности использовать различные горючесмазочные материалы в качестве единственного источника углерода и энергии.

Материалы и методы. В исследованиях использовали 5 видов горюче-смазочных материалов (ГСМ): авиационный бензин (АБ) марки Б-91–115; автомобильный бензин марки АИ–95; смесь гидравлических масел (МГ) состава: 80% марки АМГ-10 (ГОСТ 6794-75) и 20% марки МГ «А» (ГОСТ 17479.3-85); дизельное топливо (ДТ) марки Л-45 (дизельное топливо-1, отобрано в аэропорту «Сургут», дизельное топливо-2 – в аэропорту «Нижневартовск»; авиационный керосин.

Обнаружение и выделение микроорганизмов, содержащихся в ГСМ, проводили с использованием микробиологических сред различного состава: разбавленном в 10 раз питательном бульоне и минеральной среде Таусона. Среды имели следующий состав: 1) питательный бульон (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки – 1,8; NaCl – 0,2; глюкоза – 2,0; 2) Таусона (г/л): Ca(NO3)2 × 4H2O – 1,0; KNO3 – 0,25; KH2PO4 – 0,25; MgSO4 × 7H2O – 0,25; FeSO4 × 7H2O – 0,005. Среды инокулировали топливами в 4 концентрациях – 1%, 2%, 5%, 10% по объему среды. Культивирование проводили с периодическим взбалтыванием. Количественный учет и последующее выделение микроорганизмов проводили чашечным методом на плотных средах того же состава. Идентификацию накопительных культур до рода, выделенных из ГСМ, проводили по культуральным и физиологобиохимическим свойствам согласно Определителю бактерий Берджи (1997). Способность микроорганизмов использовать авиационные топлива и другие ГСМ в качестве единственного источника углерода выявляли в минеральной среде Таусона в качестве основы с добавкой стерильного топлива в двух концентрациях 0,1% и 0,01% по объему с инокуляцией данной смеси накопительными культурами выделенных изо-лятов с титром 1 млн.кл/мл, приготовленным по стандартам мутности. Активность роста бактериальных культур оценивалась по оптической плотности суспензии при длине волны 450 нм на фотоэлектроколориметре.

Результаты и их обсуждение . Использование различных концентраций топлив и составов сред культивирования позволили определить оптимальный объем топлива для максимального выделения микроорганизмов, способных поражать данные субстраты. При использовании органической среды наиболее пригодными оказались низкие концентрации (1%) добавляемых топлив. Использование минеральной среды Таусона, наоборот, требует большего объема (5-10%) топлива. В этом случае источником углерода выступает исследуемый субстрат.

В исследованиях по обнаружению микроорганизмов в ГСМ выявлено, что максимальная обсемённость характерна для смеси гидравлических масел (ГМ), что свидетельствует о доступности различных источников углерода, содержащихся в ГМ. Численность микроорганизмов при разных концентрациях смеси масел варьировала в пределах 5,0-47,2 млн.кл/мл топлива. Присутствующая микрофлора ГМ представлена, в основном, бактериальными формами.

В итоге различные концентрации топлив позволили выделить гетеротрофные культуры наиболее часто встречающиеся/выделяющиеся в/из ГСМ, принадлежащие к 6 родам: Pseudomonas, Enterococcus, Rhodococcus, Nocardia, Mycobacterium, Arthrobacter. В частности, из дизельного топлива выделены изоляты культур: Rhodococcus sp.1, Pseudomonas sp.1, Rhodococcus sp.2, Pseudomonas sp.3, Arthrobacter sp.1; из гидравлического масла – Pseudomonas sp.2, Nocardia sp.1, Enterococcus sp.1; из бензина марки А-98 – Pseudomonas sp.4, Pseudomonas sp.5; из бензина марки Б-91/115 (отработки) – Pseudomonas sp.6, Mycobacterium sp.1; из авиационного керосина – Arthrobacter sp.2.

Способность микроорганизмов использовать авиационные топлива и другие ГСМ в качестве единственного источника углерода оценивали в лабораторных экспериментах с разным временем культивирования: 1) от 110 до 190 суток; 2) от 50 до 80 суток; 3) от 10 до 40 суток. Для постановки первого эксперимента использовались 5 образцов ГСМ: бензин отработка, авиационный керосин, дизельное топливо, гидравлическое масло, бензин А-98 и 5 гетеротрофных изолятов бактерий: Pseudomonas sp.1, Pseudomonas sp.2, Pseudomonas sp.3, Rhodococcus sp.2 , Nocardia sp.1.

При добавке дизельного топлива и бензина-отработки выявлено, что динамика численности 2 изолятов Pseudomonas sp. 2 и Pseudomonas sp. 3 сходна: при концентрации 0,1%, как для дизельного топлива, так и бензина-отработки, пик численности приходится на 121 сутки эксперимента. Концентрация топлив 0,01% сдвигает максимально фиксируемую численность на окончание опыта. Также это характерно для всех изучаемых культур с добавкой дизельного топлива. Угасание активности роста к концу эксперимента наблюдается с добавкой бензина-отработки (0,01%) для изолятов Pseudomonas sp.1, Rhodococcus sp.2, Nocardia sp.1. Добавка авиационного керосина в качестве субстрата позволила выявить явных доминантов по численности среди испытуемых бактериальных культур. Наиболее активно авиационный керосин используется изолятами Nocardia sp.1 и Rhodococcus sp.2 (рис. 1).

Рис. 1. Численность изолятов бактериальных культур за время длительного эксперимента при культивировании с авиационным керосином

Бензин марки А-98 активно используется изолятом Rhodococcus sp.2 и изолятами рода Pseudomonas. Пики численности фиксируются с начала снятия результатов. Изолят Nocardia sp.1 достигает максимальных значений только к концу. При добавлении гидравлического масла пик активности роста всех культур в обеих концентрациях приходится на 121 сутки эксперимента (рис. 2). Следует отметить, что при добавке гидравлического масла, зафиксированы максимальные значения численности изучаемых бактериальных культур: 2-5 млрд.кл./мл. По результатам проводимого длительного эксперимента, можно заключить, что в авиационном керосине наиболее активно развиваются культуры родов Nocardia sp.1 и Rhodococcus sp.2. Наблюдается тенденция: большая численность микроорганизмов фиксируется при более высокой концентрации добавляемых топлив. Выделенные культуры Pseudomonas sp.2 и Pseudomonas sp.3 обладают сходными свойствами. При этом места их выделения различны: Pseudomonas sp.2 выделен из гидравлического масла, а Pseudomonas sp.3 – из дизельного топлива.

Рис. 2. Численность изолятов бактериальных культур за время длительного эксперимента

сутки

■ Pseudom. sp3 ■ Rhodococcus sp2 ■ Rhodococctis sp2

при культивировании с гидравлическим маслом

Для постановки эксперимента №2 использованы четыре образца ГСМ: дизельное топливо-2, авиационный керосин, гидравлическое масло, бензин А-98 и 4 гетеротрофных изолята бактерий, принадлежащие к разным родам Mycobacterium sp.1, Rhodococcus sp.1, Enterococcus sp.1, Pseudomonas sp.4. Численность бактерий рода Mycobacterium sp.1 при культивировании с дизельным топливом-2 остается минимальной по сравнению с другими культурами на протяжении всего времени эксперимента. Наибольшую активность в лабораторном культивировании показали культуры родов Enterococcus sp.1 и Rhodococcus sp.1. Здесь значения численности составляют 800-950 млн.кл/мл. Внесение в среду культивирвоания авиационного керосина изменило картину численности бактериальных кульур относительно изучаемых родов. Максимальная численность выявлена для Rhodococcus sp.1 и для Pseudomonas sp.4 в обеих концентрациях добавляемого топлива. Отмечено, что почти для всех родов наблюдается постепенное увеличение численности, достигая пиковых значений к окончанию эксперимента. Исключение составляет культура рода Enterococcus sp.1 при концентрации 0,01%, когда пик активности приходится уже на 65 сутки эксперимента, что может свидетельствовать о более быстрой адаптации к субстрату. Активность изолята Mycobacterium sp.1 немного возрастает, но остается минимальной по сравнению с другими культурами. Гидравличское масло, как субстрат для культивирования микроорганизмов, нарушает ранее выявленную тенденцию, что при большей концентрации добавляемого топлива фиксируется большая численность бактерий. Здесь наблюдается обратная взаимосвязь: меньшая концентрация – большая численность. В предыдущих 2 случаях (дизельное топливо-2 и авиационный керосин) тенденция сохраняется. Добавление гидравлического масла в среду культивирования выступило стимулирующим фактором для бактерий рода Mycobacterium sp.1: зафиксированы одни из наибольших значений по численности, которые характерны и для изолятов Pseudomonas sp.4 и Rhodococcus sp.1 (рис. 3).

При добавлении в среду культивирования бензина марки А-98 максимальная численность изучаемых изолятов достигается на 77-е сутки эксперимента, причем в обеих добавляемых концентрациях. Стабильные результаты, с постепенным нарастанием численности во времени, показывают культуры родов Mycobacterium sp.1 и Enterococcus sp.1. Также можно отметить, что численность изучаемых бактериальных культур в обеих концентрациях добавляемого бензина приблизительно одинаковые и достигают значений 580-940 млн.кл/мл.

Рис. 3. Численность изолятов бактериальных культур за время эксперимента №2 при культивировании с гидравлическим маслом

Таким образом, выявлены определенные зависимости между семейством/родом бактериальной культуры и видом топлива, используемого микроорганизмами в качестве субстрата. Данные представлены в табл.1., где изоляты бактерий указаны в порядке уменьшения их активности. Следовательно, для культуры Enterococcus sp.1 наиболее выгодным субстратом является дизельное топливо-2; для Pseudomonas sp.4 – авиационный керосин. В гидравлическом масле наиболее активно развиваются микроорганизмы сем. Mycobacteriaceae (Mycobacterium sp.1) и в бензине марки А-98, – бактерии сем. Nocardi-aceae (Rhodococcus sp.1).

Таблица 1. Активность бактериальных культур по отношению к видам топлив

Ряд	Дизельное топливо-2	Авиационный керосин	Гидравлическое масло	Бензин А-98
1.	Enterococcus sp.1	Pseudomonas sp.4	Mycobacterium sp.1	Rhodococcus sp.1
2.	Rhodococcus sp.1	Rhodococcus sp.1	Pseudomonas sp.4	Mycobacterium sp.1
3.	Pseudomonas sp.4	Enterococcus sp.1	Rhodococcus sp.1	Enterococcus sp.1
4.	Mycobacterium sp.1	Mycobacterium sp.1	Enterococcus sp.1	Pseudomonas sp.4

Для постановки третьего эксперимента использовались 5 образцов ГСМ: авиационный керосин, дизельное топливо-1, дизельное топливо-2, гидравлическое масло, бензин А-98 и выбрано 4 гетеротрофных изолята бактерий двух родов: Arthrobacter sp.1, Arthrobacter sp . 2 и Pseudomonas sp . 5, Pseudomonas sp.6. Дизельное топливо-1 в концентрации 0,1% стимулирует рост изолята Arthrobacter sp.2, – численность резко повышаться на 21-е сутки эксперимента. Другая культура этого же рода, Arthrobacter sp.1, показывает стабильные результаты в течение эксперимента и значения численности к окончанию эксперимента повышаются только в 2 раза. При концентрации 0,01%, наоборот, более активна культура Arthrobacter sp.1, чем Ar-throbacter sp.2. Пик численности Arthrobacter sp.1 наблюдается уже на 11-е сутки эксперимента. Для Arthrobacter sp.2 зафиксированы стабильные результаты во времени. Сходная ситуация наблюдается и в изолятах рода Pseudomonas. Для Pseudomonas sp.5 характерно постепенное повышение численности во времени в обеих концентрациях топлива. Для культуры Pseudomonas sp.6 при концентрации 0,1% пик численности приходится на 38-сутки, а при 0,01% - на начало эксперимента (11 сутки). Численность всех культур при лабораторном культивировании с добавлением дизельного топлива-2

высокая, причем значения приблизительно одинаковые в обеих добавляемых концентрациях. Это свидетельствует о доступности микроорганизмам данного топлива как субстрата.

В среде с авиационным керосином (0,1%) изоляты родов Arthrobacter к концу эксперимента показали резкий подъем активности. Для изо-лятов рода Pseudomonas численность незначительно изменилась на протяжении эксперимента (рис. 4). При концентрации 0,01% прослеживается постепенное увеличение численности с течением времени. Также, следует обратить внимание на численность при разных концентрациях авиационного керосина: при большей концентрации значения численности микроорганизмов выше.

В гидравлическом масле активность бактериальных культур увеличивается с течением времени, достигая максимальной численности в обеих концентрациях топлива на 38 сутки эксперимента (рис. 5). При этом численность микроорганизмов при концентрации гидравлического масла 0,01% не уступает таковой при его более высокой концентрации. Следует отметить значительно превышающую активность культур рода Arthrobacter при культивировании с гидравлическим маслом по сравнению с культурами рода Pseudomonas .

Рис. 4. Численность изолятов бактериальных культур за время эксперимента №3

при культивировании с авиационным керосином

Рис. 5. Численность изолятов бактериальных культур за время эксперимента №3

Гидравлическое масло кони 0,01°

Время, сутки

при культивировании с гидравлическим маслом

Бензин марки А-98 оказался вполне пригодным для микроорганизмов субстратом. Наблюдается определенная динамика роста бактериальных культур, но численность остается одной из самых низких. Изоляты Pseudomonas sp.6 и Arthrobacter sp.2 в обеих концентрациях добавляемого топлива проявили пик своей активности на 38 сутки. Наиболее низкие значения численности при культивировании с бензином марки А-98 выявлены для культуры Pseudomonas sp.5.

Выводы:

• 1.    В краткосрочном эксперименте на всех видах топлив наибольшая активность выявлена для культур Arthrobacter sp.1 и Pseudomonas sp.6; наименьшая, – для культуры Pseudomonas sp.5. Сопоставляя результаты трех временных экспериментов, мы сделали вывод, что краткосрочный эксперимент в пределах 50-60 суток культивирования при постановке исследований с горюче-смазочными материалами, является наиболее оптимальным. Проведя данные исследования можно заключить, что различные ГСМ, применяемые в условиях северных регионах,

• 2.    Показано, что все использованные хемо-гетеротрофные культуры имеют тенденцию роста (увеличение численности) в течение эксперимента, причём большая концентрация (0,1%) добавляемого топлива является причиной более высокой численности бактерий, т.е., исследованные культуры способны активно усваивать углерод топлив.

• 3.    Учитывая активность культур и доступность для микроорганизмов углерода, ГСМ расположились в ряд (по убыванию): гидравлическое масло – дизельное топливо-2 – дизельное топливо-1 – бензин марки А-98 – авиационный керосин. Таким образом, гетеротрофные бактериальные культуры наиболее активно используют углеводороды/углерод гидравлического масла и наименее, – авиационного керосина, что может быть связано с более высокой степенью очистки керосина и применяемых в нем присадок.

чаще всего повреждаются бактериальной микрофлорой, принадлежащей к родам: Pseudomonas, Enterococcus, Rhodococcus, Nocardia, Mycobacterium, Arthrobacter.