Биопрепарат на основе штамма Escherichia coli ZP. Сообщение I. Оценка эффективности колицина при конъюгативной доставке colE7 в клетки APEC in vitro и in vivo

Обеспечение защиты сельскохозяйственных животных от инфекционных болезней - приоритетное направление ветеринарной медицины. Широкое распространение в птицеводческих хозяйствах патогенных и условно-патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, требует разработки современных способов поддержания здоровья птицы при ее промышленном производстве. В качестве меры по предупреждению и ограничению распространения возбудителей с устойчивостью к противомикробным агентам перспективно использование бактериальных препаратов направленного действия - пробиотиков. В настоящей работе в экспериментальных моделях in vitro и in vivo мы впервые показали антагонистическое действие генно-модифицированного штамма Escherichia coli ŽP против возбудителей эшерихиозов у птиц - АPEC (avian pathogenic Escherichia coli ). Установлено, что in vitro конъюгативный перенос гена сolE7 в клетки APEC проходит эффективно в условиях как планктонного роста, так и формирующейся биопленки. In vivo штамм E. coli ŽP способен активно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов и сохраняться там, способствуя нормализации микробиоты животных. Цель исследования - оценка эффективности киллинга клеток APEC при конъюгативном переносе гена колицина E7 и определение конкурентоспособности штамма E. coli ŽP in vitro и in vivo . В работе использовали ColE7-опосредованную kill-anti-kill систему на основе пробиотического штамма Nissle 1917, включающую генно-модифицированный штамм E. coli ŽP (киллерный донор), несущий на конъюгативной плазмиде pOX38а ген колицина E7 ( сolE7 ) с ДНКазной активностью, а также ген immE7 в хромосоме, и штамм E. coli N4i без colE7 на плазмиде (контрольный донор). В качестве реципиентов использовали устойчивые к ампициллину штаммы APEC ( n = 6), изолированные из внутренних органов инфицированных цыплят-бройлеров. Филогенетическую принадлежность культур определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (quadriplex PCR). Конъюгативный перенос осуществляли в среде Луриа-Бертани (LB) в течение 6 и 24 ч в планктонной культуре и в биопленке в полистироловых плоскодонных иммунологических 96-луночных планшетах. Опыты на крысах (линия Wistar) и маньчжурских перепелах ( Coturnix coturnix ) выполняли в виварии (ГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ). Нами экспериментально подтверждена конкурентоспособность E. coli ŽP при совместном культивировании с клетками APEC штаммов, в том числе продуцентами бактериоцинов, в различных моделях. Доказан конъюгативный перенос гена сolE7 в клетки APEC in vitro в условиях планктонного роста и формирующейся биопленки: в экспериментах с донорным штаммом E. coli N4i частота конъюгации варьировала в пределах 10-6-10-2. Эксперимент in vivo показал, что штамм E. coli ŽP способен эффективно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов, сохраняясь там, как минимум, в течение 1 мес. Введение клеток E. coli ŽP с питьевой водой увеличивало общее содержание комменсальных эшерихий в кишечнике, подавляя развитие патогенных представителей этого вида без заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору. Доказана возможность конъюгативного переноса плазмиды от донора E. coli N4i в условиях кишечного тракта обоих видов животных, который происходил с высокой частотой (в среднем 10-2). В экспериментах in vitro и in vivo с E. coli ŽP трансконъюганты обнаружены не были, то есть клетки реципиентов, получившие ген сolЕ7 посредством конъюгативного переноса, экспрессировали его и были лизированы вследствие ДНКазной активности колицина. В группах, получавших штамм ŽP, также отмечено снижение числа реципиентов АРЕС. Полученные результаты свидетельствуют, что штамм E. coli ŽP способен эффективно заселять кишечник животных и обладает антибактериальной активностью против энтеропатогенов за счет конъюгативного механизма передачи гена колицина. Он эффективно действует на резистентные и толерантные к бактериоцинам клетки, что позволяет предположить возможность создания на его основе высокоэффективного пробиотического препарата нового поколения.