Биораспределение микросфер альбумина, меченных 188Re, при различных путях введения

Радионуклидная терапия (РНТ) представляет собой высокоэффективный малоинвазивный метод лечения онкологических заболеваний. Основной задачей РНТ является доставка радиоактивного излучения непосредственно к опухолевым клеткам при минимальном радиационном повреждении окружающих здоровых органов и тканей. Оптимальными соединениями для этих целей могут служить микросферы, меченные β-излучающими радионуклидами: 90Y, 131I, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re и др. [1, 2].

В настоящее время микросферы, меченные 90Y и 166Ho, успешно применяются для трансартериальной радиоэмболизации химиорезистентного и неоперабельного рака печени [3, 4]. Ведётся разработка радиофармацевтических лекарственных препаратов (РФЛП) на основе микросфер для радиосиновэтомии – местной терапии воспалительных заболеваний суставов, заключающейся в разрушении воспалённой синовиальной оболочки при внутрисуставном введении препарата [5, 6].

Материалами для получения микросфер могут служить стекло, ионообменные смолы, различные полимеры, альгинат, желатин, крахмал, гидроксиапатит и др. [1, 6, 7]. В отличие от вы-

Тищенко В.К. – вед. науч. сотр., к.б.н.; Петриев В.М.* – зав. лаб., д.б.н., проф. НИЯУ МИФИ; Власова О.П. – вед. науч. сотр., к.б.н.;

Степченкова Е.Д. – мл. науч. сотр. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

шеперечисленных материалов, микросферы на основе сывороточного альбумина крови человека (МСА) обладают рядом преимуществ: простота получения, биосовместимость, способность метаболизироваться в организме без образования токсических продуктов, а также способность связывать радионуклиды с разными химическими свойствами за счёт пористой структуры МСА и высвобождать их одновременно с протеолизом денатурированного белка [8].

¹⁸⁸Re – идеальный изотоп для РНТ с периодом полураспада Т 1/2 =16,9 ч и высокой энергией бета-излучения (E β max =2,12 МэВ). Кроме того, наличие низкоэнергетического гамма-излучения (E γ =155 кэВ (15%)) позволяет отслеживать распределение РФЛП с ¹⁸⁸Re в организме. Важным преимуществом ¹⁸⁸Re является также возможность его получения из генераторной системы ¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re с высокой удельной активностью непосредственно в условиях клиники в течение 6-8 месяцев. Сообщается о возможности мечения ¹⁸⁸Re микросфер из стекла [9], полимерных смол [10], природных и синтетических полимерных материалов [11, 12]. Однако, до сегодняшнего дня клинические исследования проводились только с меченными ¹⁸⁸Re микросферами альбумина [13, 14]. Таким образом, МСА являются перспективными носителями радиоактивной метки и характеризуются высокой степенью избирательного накопления в органах и тканях, что определяется не только их физико-химическими параметрами, но и способами введения в организм.

Цель данной работы – изучить биораспределение микросфер сывороточного альбумина человека, меченных 188Re (188Re-МСА), в организме лабораторных животных при различных путях введения.

Материалы и методы

Получение и контроль качества ¹⁸⁸Re-МСА. Методика получения МСА, основанная на термической денатурации белка в оливковом масле при постоянном перемешивании реакционной системы, описана в [15, 16]. После фракционирования МСА с использованием ультразвуковых микросит, 95% частиц находились в диапазоне 10-20 мкм.

МСА метили ¹⁸⁸Re, как описано в [16], с использованием элюата Na¹⁸⁸ReO 4 в изотоническом растворе. Раствор Na¹⁸⁸ReO 4 получали путём элюирования 0,9% раствором NaCl с колонки генератора ¹⁸⁸Re ГРЕН-1 (¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re генератор) производства Акционерного общества «Государственный научный центр Российской Федерации – Физико-энергетический институт имени А.И. Лейпунского». Радионуклидная чистота элюата Na¹⁸⁸ReO 4 была выше 99%, объёмная активность – 1,85 МБк (50 мкКи).

Инъекционная форма препарата «¹⁸⁸Re-МСА» содержит: общий объём суспензии ¹⁸⁸Re-МСА в физиологическом растворе составляет 5 мл; концентрация ингредиентов: МСА – 2 мг/мл; частиц – 715000 шт./мл; SnCl 2 ^. 2H 2 O – 1,4 мг/мл; аскорбиновая кислота – 2 мг/мл; объёмная активность – 1,85 МБк/мл (50 мкКи/мл).

Проведение биологических исследований. Изучение биораспределения ¹⁸⁸Re-МСА при внутривенном и внутримышечном введении препарата проводили на беспородных белых мышах и при внутриопухолевом введении – на инбредных мышах С57Bl/6. Средняя масса животных составляла 22±3 г. Всего было использовано 100 животных.

Для получения солидного варианта аденокарциномы Льюиса брали мышь-донора С57Bl/6 с опухолью, декапитировали и выделяли опухолевую ткань. Затем опухолевую ткань измельчали, разводили в физиологическом растворе в соотношении 1:2, добавляли пенициллин и стрептомицин в дозе 100 ед. на 1 мл суспензии опухолевой массы. Полученную взвесь опухолевой ткани вводили подкожно по 0,2 мл в область бедра мышам С57Bl/6. В опыт брали животных на 10 сутки после перевивки опухоли.

Животным вводили внутривенно (в хвостовую вену), внутримышечно (в мышцу бедра) и внутриопухолево (в центр опухоли) по 0,185 МБк (5 мкКи) суспензии 188Re-МСА в 0,1% растворе Твина-80 в физиологическом растворе в объёме 0,1 мл.

В различные сроки (через 5 мин, 1, 3, 24, 48 и 72 ч) после введения 188Re-МСА по 4-5 животных на каждый срок подвергали эвтаназии путём декапитации (под наркозом), выделяли пробы органов и тканей, помещали их в пластиковые пробирки, взвешивали на электронных весах «Sartorius» (Германия) и проводили радиометрию с помощью автоматического гамма-счётчика «Wizard» версии 2480 фирмы PerkinElmer/Wallac (Финляндия). На момент введения в отдельную пробирку отбирали пробу 188Re-МСА в объёме 0,1 мл для использования в качестве стандарта введённой дозы. По данным радиометрии на каждый срок наблюдения рассчитывали количество радиоактивности на 1 г органа или ткани в % от введённой дозы (%/г), а также общее содержание активности в некоторых органах или тканях с использованием непосредственно полученных результатов взвешивания органов или таблиц среднего веса соответствующих органов или тканей крыс [17]. Также были рассчитаны коэффициенты дифференциального накопления (КДН) как частное от деления величин концентрации 188Re-МСА в опухоли и остальных органах и тканях.

Статистическая обработка результатов. При статистической обработке результатов радиометрии определяли показатели средних арифметических значений (М) и стандартных ошибок среднего (±m) в программе Microsoft Excel 2010. Сравнение уровней накопления радиоактивности в группах проводилось с помощью t-критерия Стьюдента в программе OriginPro 2019b. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Сравнительные данные биораспределения 188Re-МСА диаметром 10-20 мкм по органам и тканям интактных мышей при внутривенном и внутримышечном введении препаратов представлены в табл. 1. Данные таблицы наглядно демонстрируют, что способ введения существенно влияет на поведение 188Re-МСА в организме интактных мышей. Об этом свидетельствуют статистически значимые различия (p<0,001-0,05) практически во все сроки наблюдений для значений активности при внутривенном и внутримышечном введении.

Характерной особенностью поведения ¹⁸⁸Re-МСА при внутримышечной инъекции являлось существенно более низкое накопление активности во всех органах и тканях (кроме мышцы бедра) по сравнению с внутривенным введением (табл. 1). Наиболее значительные различия отмечаются в интервале от 5 мин до 3 ч, в последующие сроки эти различия становятся менее заметными. Такая специфика кинетики активности объясняется более высокой скоростью метаболизма ¹⁸⁸Re-МСА в лёгких по сравнению с мышечной тканью. При этом ¹⁸⁸Re-МСА характеризовались высокой стабильностью in vivo , что подтверждается различиями в биораспределении ¹⁸⁸Re-МСА и Na¹⁸⁸ReO 4 [18]. Напротив, ¹⁸⁸Re-МСА, депонированные в мышце бедра, практически не подвергаются протеолизу в течение первых трёх часов, чем и объясняется низкий уровень активности в органах и тканях в этот период. Через 24 ч ¹⁸⁸Re-МСА начинали подвергаться протеолитическому процессу, и высвобождающийся ¹⁸⁸Re из микросфер всасывался в кровь и поступал во все органы и ткани.

При внутривенном введении 188Re-МСА максимальное накопление активности отмечалось в лёгких (до 311,3±12,8%/г) уже через 5 мин после введения с постепенным снижением в последующие сроки. За 72 ч количество 188Re-МСА в лёгких снизилось более чем в 2 раза до 143,3±2,99%/г. При внутримышечном введении концентрация препарата в лёгких не превышала 0,100±0,001%/г (табл. 1).

Таблица 1

Биораспределение 188Re-МСА диаметром 10-20 мкм в организме интактных мышей после внутривенного и внутримышечного введения препарата

(в % от введённого количества на 1 г органа или ткани)

Наименование Путь Время после введения препарата органа, ткани введения 5 мин 1 ч 3 ч 24 ч 48 ч 72 ч Кровь в/в в/м 0,65±0,08 0,12±0,02 p<0,001 0,74±0,08 0,09±0,01 p<0,001 0,81±0,07 0,22±0,01 p<0,001 0,22±0,02 0,12±0,02 p<0,02 0,15±0,02 0,066±0,007 p<0,02 0,11±0,01 0,041±0,007 p<0,01 Щитовидная железа в/в в/м 22,60±4,23 1,10±0,20 p<0,002 27,60±3,78 6,84±1,03 p<0,002 74,30±22,4 14,30±2,04 p<0,02 33,80±3,27 17,80±3,76 p<0,02 12,90±2,48 8,76±1,47 p>0,25 10,50±1,56 7,68±1,17 p>0,25 Лёгкие в/в в/м 311,3±12,8 0,056±0,007 p<0,001 271,4±7,24 0,070±0,007 p<0,001 276,9±25,9 0,075±0,013 p<0,001 195,5±19,9 0,100±0,001 p<0,001 179,4±12,3 0,074±0,006 p<0,001 143,3±2,99 0,027±0,003 p<0,001 Печень в/в в/м 11,20±1,31 0,044±0,007 p<0,001 10,20±0,26 0,066±0,012 p<0,001 12,70±0,55 0,11±0,01 p<0,001 10,00±0,48 0,20±0,02 p<0,001 8,10±0,66 0,16±0,01 p<0,001 7,34±0,27 0,12±0,01 p<0,001 Почки в/в в/м 3,00±0,14 0,059±0,006 p<0,001 2,49±0,22 0,25±0,02 p<0,001 2,24±0,18 0,44±0,04 p<0,001 1,23±0,03 0,46±0,02 p<0,001 1,54±0,76 0,30±0,03 p<0,05 0,52±0,04 0,19±0,02 p<0,001 Селезёнка в/в в/м 5,29±1,16 0,014±0,001 p<0,01 6,29±0,76 0,055±0,006 p<0,001 10,10±0,95 0,023±0,001 p<0,001 10,30±0,27 0,053±0,009 p<0,02 7,21±1,37 0,038±0,008 p<0,002 6,74±0,50 0,042±0,008 p<0,001 Желудок в/в в/м 1,05±0,04 0,091±0,015 p<0,001 2,65±0,35 0,49±0,06 p<0,001 5,10±1,11 0,93±0,10 p<0,01 0,69±0,08 0,70±0,06 p>0,5 0,35±0,03 0,18±0,02 p<0,002 0,22±0,05 0,063±0,012 p<0,05 Мышца бедра с введёнными МСА в/в в/м – 191,6±14,3 – 119,4±15,3 – 93,90±6,24 – 3,20±0,93 – 5,90±2,05 – 0,60±2,22 Мышца бедра интактная в/в в/м 0,089±0,012 0,019±0,001 p<0,001 0,078±0,003 0,026±0,008 p<0,001 0,026±0,003 0,040±0,002 p<0,01 0,019±0,004 0,055±0,007 p<0,01 0,025±0,002 0,029±0,003 p<0,001 0,009±0,001 0,012±0,001 p<0,05 в/в – внутривенное введение 188Re-МСА; в/м – внутримышечное введение 188Re-МСА.

При инъекции 188Re-МСА в мышцу бедра большая часть препарата удерживается в месте введения. Первоначальная концентрация 188Re-МСА в мышечной ткани бедра была 191,6±14,3%/г, и лишь через 24 ч и позднее содержание 188Re-МСА снижалось до 0,60-5,90%/г. В противоположной (интактной) мышце бедра накопление активности было крайне мало: 0,012-0,055%/г.

Особенно высокие уровни накопления активности были отмечены в щитовидной железе. Образующийся в процессе протеолиза свободный 188Re накапливается в щитовидной железе за счёт высокого сродства к транспортному белку Na/I-симпортеру, осуществляющему активный транспорт 188Re в клетки щитовидной железы [19]. При внутривенном введении концентрация 188Re-МСА достигала 74,30±22,4%/г, в то время, как при внутримышечном введении содержание препарата не превышало 17,80±3,76%/г.

После внутримышечного введения содержание препарата во внутренних органах также не превышало 1%/г во все сроки исследования (табл. 1).

Анализ динамики распределения активности в организме мышей с перевитой аденокарциномой Льюиса после внутриопухолевого введения показал, что максимальный уровень активности на протяжении всего исследования отмечался в ткани опухоли. Удельная активность 188Re-МСА в опухоли составила 16,7-26,8%/г (табл. 2).

Таблица 2 Биораспределение ¹⁸⁸Re-МСА диаметром 10-20 мкм в организме мышей с аденокарциномой Льюиса после внутриопухолевого введения препарата (в % от введённого количества на 1 г органов или ткани)

Наименование органа, ткани	Время после введения препарата
	5 мин	1 ч	3 ч	24 ч	48 ч	72 ч
Кровь	0,07±0,01	0,11±0,01	0,07±0,01	0,17±0,04	0,13±0,03	0,11±0,03
Щитовидная железа	1,57±0,37	8,25±1,23	27,00±4,28	16,20±4,04	24,60±3,12	22,20±1,73
Лёгкие	0,33±0,09	0,47±0,10	2,15±0,50	0,63±0,09	1,36±0,29	0,08±0,01
Печень	0,60±0,11	0,48±0,08	1,89±0,28	0,73±0,13	0,81±0,12	0,33±0,05
Почки	0,10±0,01	0,66±0,09	1,25±0,20	1,98±0,51	2,32±0,13	2,46±0,43
Селезёнка	0,014±0,005	0,17±0,03	0,13±0,03	0,29±0,04	0,24±0,05	0,032±0,012
Желудок	0,21±0,05	0,39±0,12	0,55±0,11	0,76±0,19	0,74±0,14	0,35±0,08
Опухоль	22,90±2,42	22,20±3,42	16,70±3,52	26,70±1,87	25,20±5,13	26,80±3,98
Мышца бедра	0,010±0,002	0,025±0,006	0,046±0,012	0,038±0,011	0,033±0,005	0,025±0,004

Необходимо подчеркнуть, что из опухоли 188Re-МСА выводились интенсивнее, чем из мышечной ткани при внутримышечном введении. За 3 ч концентрация 188Re-МСА в опухоли снизилась с 73,60±8,59% до 51,00±1,40% от введённой дозы, тогда как в бедренной мышце содержание препарата в этот период практически не изменялось и оставалось близким к 100% от введённой дозы (рис. 1). После 3 ч содержание 188Re-МСА в опухоли практически не менялось и сохранялось на уровне 50,80-52,30% от введённой дозы. В мышце, напротив, отмечалось снижение концентрации 188Re-МСА до 63,70±6,84% и 52,80±0,90% от введённой дозы в сроки 24 и 72 ч соответственно (рис. 1). Такие различия в кинетике 188Re-МСА можно объяснить тем, что метаболические процессы в опухоли протекают интенсивнее, чем в мышце, поэтому протеолиз 188Re-МСА в опухолевой ткани начинается сразу после инъекции препарата.

Рис. 1. Общее содержание ¹⁸⁸Re-МСА в месте введения (опухоли и мышечной ткани) после внутриопухолевого и внутримышечного введения.

Высокое содержание 188Re-МСА было отмечено в щитовидной железе (табл. 2). Начальная концентрация препарата составила 1,57±0,37%/г, возрастая через 1 ч до 8,25±1,23%/г и достигая максимума (27,00±4,28%/г) через 3 ч после введения.

0,21-0,76%/г (табл. 2). В мышечной ткани содержание 188Re-МСА варьировало от

0,010±0,002%/г до 0,046±0,012%/г, что практически одинаково с концентрацией 188Re-МСА в ин- тактной мышце при внутримышечном способе введения.

При анализе коэффициентов дифференциального накопления (КДН) опухоль/внутренние органы было установлено, что практически для всех органов эти величины были значительно выше 1. Лишь значения КДН опухоль/щитовидная железа в некоторые сроки (3 ч и 48 ч) не пре- вышали 1 (рис. 2).

Опухоль/кровь

Опухоль/мышца бедра

Опухоль/щитовидная железа

Рис. 2. Величины КДН у мышей с аденокарциномой Льюиса при внутриопухолевом введении ¹⁸⁸Re-МСА.

Наиболее высокими были значения КДН опухоль/мышца бедра, достигавшие 2290,0±202,0. Отношения опухоль/кровь варьировали от 179,1±39,6 до 371,8±62,5 (рис. 2).

Заключение

Таким образом, анализ биораспределения ¹⁸⁸Re-МСА диаметром 10-20 мкм в организме лабораторных животных продемонстрировал, что способ введения препарата оказывает значительное влияние на его поведение в организме. Показано, что при внутривенном введении ¹⁸⁸Re-МСА избирательно локализовались в лёгких, тогда как при внутримышечном и внутриопу-холевом введении препарата происходило его депонирование в месте введения (опухоли и мышце бедра соответственно). Постепенное выведение ¹⁸⁸Re-МСА из места инъекции сопровождалось повышением их концентрации во внутренних органах и тканях. Однако при внутримышечном введении концентрация ¹⁸⁸Re-МСА во внутренних органах и тканях статистически значимо ниже, чем при внутривенном введении. При этом выведение препарата из опухолевой ткани осуществлялось более интенсивно по сравнению с мышцей бедра. В целом следует отметить, что ¹⁸⁸Re-МСА характеризуются высокой стабильностью in vivo , что позволяет рассматривать его в качестве потенциального препарата для радионуклидной терапии опухолей разной локализации.