Биотехнологические и молекулярно-генетические характеристики линий кукурузы селекционной группы ланкастер

Развитие и использование методов клеточной инженерии, культуры клеток, тканей, органов in vitro и ДНК-технологий является отличительной чертой современного этапа развития селекции и биотехнологии сельскохозяйственных культур, среди которых кукуруза занимает лидирующее положение в мире. Результаты исследований по таким направлениям биотехнологии кукурузы как гаплоидия in vitro, клеточная селекция, генетическая инженерия, маркер-ассоциированная селекция (MAS) привели к существенной оптимизации различных этапов селекционного процесса этой гетерозисной культуры [1].

Современный генофонд кукурузы представлен десятками тысяч линий и гибридов, которые по общности происхождения делятся на группы (типы зародышевой плазмы). Гибриды линий, относящихся к различным типам зародышевой плазмы, как правило, проявляют более значительный гетерозисный эффект, в том числе и по урожайности, чем гибриды близкородственных линий. Одним из типов зародышевой плазмы, который адаптирован к жестким экологическим условиям юго-востока Украины со значительным недобором осадков и повышенными температурами в период вегетации, является группа линий и гибридов, ведущих свое происхождение от американского сорта Lancaster. Линии группы Ланкастер активно используются в селекции на жаро- и засухоустойчивость, скороспелость, как доноры высокой комбинационной способности [1,2].

Каллусогенез и регенерация растений в культуре in vitro лежат в основе биотехнологий более высокого порядка – клеточной селекции, получения сомаклональных вариантов, агробактериальной и биолистической трансформации. У кукурузы эти работы проводятся только на базе каллусной ткани

с обязательной последующей регенерацией растений, самоопылением растений-регенерантов и получением семян. Известно, что каллусогенный и регенерационный потенциал кукурузы в значительной мере определяется генотипом эксплантата, причем значительная часть коммерчески ценных генотипов оказываются неотзывчивыми в культуре in vitro . Поэтому расширение генетической базы каллусогенеза и регенерации, выяснение закономерностей распределения отзывчивых генотипов в генофонде перспективных зародышевых плазм кукурузы является основой для разработки и оптимизации методик клеточной и генетической инженерии по созданию улучшенных селекционных форм.

Молекулярно-генетические и биотехнологические особенности генотипов ценной в селекционном отношении зародышевой плазмы Ланкастер не изучены, что сдерживает применение новейших биотехнологических методов в прогнозировании комбинационной способности для оптимального подбора родительских компонентов гибридов, создании новых форм, устойчивых к стрессовым абиотическим факторам, в том числе и путем клеточной селекции in vitro и генетической инженерии.

Целью нашей работы было исследование молекулярно-генетических и биотехнологических характеристик линий кукурузы группы Ланкастер. В задачи работы входило определение каллусогенного и регенерационного потенциала линий данной группы в культуре in vitro и их анализ по маркерам однонуклеотидного полиморфизма ДНК (SNP-маркерам).

С целью изучения биотехнологических характеристик в культуре in vitro в течение вегетационных сезонов 2010-2012 г.г. исследовались 10 линий кукурузы плазмы Ланкастер: ДК267, ДК212, ДК680, ДК420-1 (подплазма Oh43); ДК633/266, ДК298 (подплазма Мо17/Oh43); ДК633, ДК3070, ДК236, ДК633/325 (подплазма Мо17mix) селекции ИСХСЗ НААНУ. Принадлежность линий к типу плазмы и типу подплазмы устанавливалась по родословным линий. Каллусную ткань получали из незрелых зародышей длиной 1-1,5 мм, изолированных из полевых донорных растений. Индукция морфогенного каллусогенеза I типа (компактный, короткоживущий каллус) и II типа (рыхлый, длительно пассируемый каллус) была выполнена по методике [3] с типизацией каллусов по [4]. Растения-регенеранты в культуре каллусной ткани были получены по методике [5].

Анализ однонуклеотидного полиморфизма ДНК проводили для 90 линий кукурузы селекции Института сельского хозяйства степной зоны НА-АНУ, компании Маис и других селекционных учреждений Украины с использованием панели из 384 SNP-маркеров на базе фирмы BioDiagnostics, Inc. (США). Для SNP-анализа использовали анализатор Illumina’s BeadXpress Reader. SNP-анализ и обработку полученных результатов вели по протоколам, изложенным в [6-9].

Поскольку зародышевая плазма Ланкастер достаточно обширна, для биотехнологической харак- теристики каллусогенеза и регенерации были отобраны линии, представляющие 3 основные ее подплазмы. Подплазма Oh43 ведет свое происхождение от линии Oh43 и в нашем эксперименте была представлена линиями ДК267, ДК212, ДК680, ДК420-1. Подплазма Мо17/Oh43 включает линии, полученные при объединении генетического материала линий Мо17 и Oh43 (ДК633/266, ДК298). Подплазма Мо17mix создавалась в селекционных программах для увеличения продуктивности и адаптационного потенциала путем сочетания комплексов генов линии Мо17 плазмы Ланкастер с генетическим материалом других зародышевых плазм – Европейский флинт, Миндзенпуста и других (ДК633, ДК3070, ДК236, ДК633/325).

Морфогенный каллусогенез I типа был получен у 90% изученных линий, а II типа – у 100%. В таблицах 1 и 2 представлена характеристика варьирования частоты морфогенного каллусогенеза у представителей трех подплазм зародышевой плазмы Ланкастер.

Таблица 1 . Частота образования каллусной ткани I типа у линий кукурузы зародышевой плазмы Ланкастер

	Показатель	Подплазмы плазмы Ланкастер
		Oh43	Mo17/Oh43	Mo17mix
	2010 год
	^Н m Jq_ g , %	31,58±2,80	19,87±2,91	–
	Lim, %	0,00÷78,67	0,00÷54,55	–
	V, %	105,6	93,4	–
	2011 год
	^Н ти f q а § , %	7,58±2,23	5,66±2,60	11,78±2,54
	Lim, %	0,00÷20,00	0,00÷24,00	0,00÷45,28
	V, %	82,2	162,5	127,8
	2012 год
	х tmi^, %	15,54±2,57	91,14±3,46	5,40±1,95
	Lim, %	0,00÷64,00	84,00÷100,00	0,00÷36,00
	V, %	162,5	7,1	209,4
Прим. V – коэффициент вариации

Таблица 2 . Частота образования каллусной ткани II типа у линий кукурузы зародышевой плазмы Ланкастер

Показатель	Подплазмы плазмы Ланкастер
	Oh43	Mo17/Oh43	Mo17mix
2010 год
^Н ти f q а § , %	19,28±2,37	61,72±3,54	–
Lim, %	1,33÷56,25	22,08÷91,09	–
V, %	86,72	36,50	–
2011 год
х ±mto,5, %	63,49±4,05	79,56±4,53	39,69±3,86
Lim, %	2,78÷100,00	50,00÷100,00	0,00÷100,00
V, %	44,75	19,82	91,06
2012 год
^ -!— ^*^ ^ 0.5 , %	44,99±3,52	2,58±1,93	56,24±4,90
Lim, %	14,00÷73,17	0,00÷8,00	6,00÷94,74
V, %	42,85	142,25	59,82

Каллусы кукурузы I и II типов представляют со- логическому потенциалу. Они различаются по спо-бой образования, различные как с точки зрения собности поддерживаться в культуре, по времени морфогенетических потенций, так и по биотехно- наступления и интенсивности регенерации расте- ний, частоте возникновения на их основе сомакло-нальних вариантов. Эти и другие особенности позволяют каллусным тканям двух типов дополнять друг друга в биотехнологиях, которые в качестве базисного включают этап каллусогенеза и регенерации.

Известно, что способность к каллусогенезу зависит от физиологического состояния донорного растения и самих эксплантатов на момент введения их в культуру in vitro, что напрямую определяется погодно-климатическими условиями, складывающимися в год проведения исследований. Как видно из табл. 1 и 2, интенсивность каллусогенеза І и ІІ типов у представителей различных подплазм в разные годы варьировала, причем размах варьирования по частоте образования каллусов І типа был больше (7,14-209,44%), чем каллусов ІІ типа (19,82142,25%). Из трех лет исследований, которые существенно различались по количеству осадков и температуре воздуха в период вегетации донорных растений, наиболее благоприятными для реализации каллусогенного потенциала были годы, не одинаковые, как для двух типов каллусной ткани, так и для трех подплазм плазмы Ланкастер. Этот факт еще раз подтверждает закономерность, согласно которой образование двух типов каллусной ткани контролируется различными генетическими системами, а также подчеркивает роль, которую играет в развитии каллусогенной способности взаимодействие генотипических и экологических факторов. Значительное варьирование способности к каллусогенезу исследованных подплазм плазмы Ланкастер проявляется не только в величине средних, но и предельных значений признаков и коэффициентах их вариации. Наибольшую стабильность каллусогенной способности в различные годы обеспечивал генетический материал подплазмы Oh43, как самостоятельно, так и при добавлении его к Мо17.

Способность к регенерации среди исследованных подплазм проявили только Oh43 и Мо17/Oh43 (табл. 3), причем более стабильными в проявлении регенерационной способности были представители подплазмы Oh43. В среднем регенерационная способность находилась на уровне 13-16%, хотя у отдельных линий достигала 75%, что свидетельствует о значительном регенерационном потенциале зародышевой плазмы Ланкастер и необходимости дальнейшей оптимизации состава питательных сред и условий культивирования для его полной реализации.

Таблица 3 . Регенерационная способность каллусной ткани кукурузы зародышевой плазмы Ланкастер

Показатель	Подплазмы плазмы Ланкастер
	Oh43	Mo17/Oh43	Mo17mix
^ ^Н ти f q а § , %	16,67±5,48	13,57±7,02	0
Lim, %	0,00÷53,33	0,00÷75,00	0
V, %	105,28	182,02	0

Все исследованные нами подплазмы плазмы Ланкастер были в целом отзывчивы на культивирование in vitro и сформировали каллусы обоих типов, однако линии внутри каждой подплазмы различались по каллусогенной способности, поэтому мы выделили лучшие линии, которые в дальнейшем могут служить базовыми для своих подплазм в экспериментах по генетической инженерии и сома-клональному варьированию. В подплазме Oh43 это линии ДК267 и ДК420-1 для получения каллусов І типа и линии ДК212 и ДК680 для получения каллусов ІІ типа, в подплазме Мо17/Oh43 – ДК298 для каллусов І типа и ДК633/266 для каллусов ІІ типа. Способность к регенерации проявили линии ДК267, ДК680, ДК420-1 и ДК298.

Анализ биотехнологических характеристик тех или иных генотипов в культуре in vitro является длительным, трудоемким и, как показали проведенные исследования, в значительной степени зависит от условий внешней среды. В связи с этим представляет интерес выявление линий кукурузы, которые по генотипу будут наиболее близкими к типичным линиям зародышевой плазмы Ланкастер, формирующим основные подплазмы, – линиям Oh43 и Мо17. Специфический для этих и других линий набор нуклеотидов ДНК является независи- мым от экологических факторов среды. Оценка полиморфизма ДНК различных популяций молекулярно-генетическими методами в последние годы приобрела широкую популярность из-за возможности точного определения аллельного состояния маркерных локусов и использования полученной информации в паспортизации и кластеризации селекционных образцов, картировании генов и маркировании фенотипических признаков. Существуют различные типы маркеров, среди которых для выявления генетического полиморфизма ДНК применяются RFLP-, PCR- и SNP-маркеры. SNP-маркеры в последнее время для кукурузы используются наиболее широко из-за их значительной распространенности в геноме и возможности автоматизированной массовой оценки образцов. Мы использовали SNP-анализ (анализ однонуклеотидного полиморфизма) для генотипирования 90 перспективных в селекционном отношении линий кукурузы, которые характеризовались высокой комбинационной способностью и устойчивостью к абиотическим факторам, складывающимся в период вегетации в степной зоне Украины.

Анализ однонуклеотидного полиморфизма ДНК линий украинской селекции, выполненный по 384 биаллельным SNP-маркерам, расположенным на всех 10 хромосомах гаплоидного набора, показал, что чаще всего в маркерных локусах встречается дезоксиаденозинмонофосфат и дезоксигуанозинмонофосфат, а наиболее распространенным типом однонуклеотидных замен являются транзиции пуриновых нуклеотидов. Проанализированный набор линий характеризовался гомозиготностью маркерных локусов на уровне 99,8% и генным разнообразием в пределах 0,1634-0,1921 при максимально возможном диапазоне 0,0001-0,5000. Для проанализированного набора линий доля SNP-маркеров с частотой пропущенных данных >20% составила 5,2%, а выявивших диморфное состояние – 98,6%. Частота минорного аллеля (MAF) в исследованном наборе линий в среднем составила 0,3147, модальным классом MAF был класс 0,4000-0,4999. MAF<0,05 имели 1,7% маркеров, MAF>0,2 (нормальную частоту минорного аллеля) – 79,3% маркеров, а 1,4% маркеров выявили равновесные частоты аллелей. Индекс полиморфизма (PIC) для использованных маркеров в данном наборе линий кукурузы в среднем составил 0,3114, к модальному классу PIC 0,350-0,375 принадлежали 47,5% маркеров. Высокоинформативными маркерами, то есть теми, которые имели показатель смещения генного разнообразия >0,32 и PIC>0,25, оказались 83,4% SNP-маркеров. Обобщение характеристик проявле- ния маркеров в наборе линий украинской селекции позволо отобрать информативные маркеры высокого качества для дальнейшего использования в генотипировании, кластерном и компонентном анализе.

Анализ генетической структуры популяции из 90 линий кукурузы с использованием пакета программного обеспечения STRUCTURE по [10] позволил оценить разнообразие генетического материала в генофонде рассмотренных линий и разделить их на k =5 подгрупп. По каждой из исследованных линий были рассчитаны коэффициенты участия ( Q -коэффициенты) для оценки степени принадлежности линии к той или иной подгруппе по аллельному состоянию SNP-локусов. Принадлежащими к определенной подгруппе считаются линии с Q ≥0,600. Для I подгруппы наиболее типичной является линия В73 ( Q =0,998), для II подгруппы – Oh43 ( Q =0,989), для III подгруппы – Мо17 ( Q =0,998), для IV подгруппы – МС3 ( Q =0,998), для V подгруппы – В14 ( Q =0,997). К плазме Ланкастер относятся II и III подгруппы. В проанализированном наборе из 90 линий украинской селекции ко II подгруппе (Oh43) принадлежали 35 линий с диапазоном Q =0,600-0,984, а к III подгруппе (Мо17) – 7 линий с диапазоном Q =0,774-0,997. Первые 5 линий II и III подгрупп как наиболее типичные приведены в таблице 4.

Таблица 4 . Линии украинской селекции, принадлежащие к подгруппам Oh43 и Мо17 по результатам SNP-анализа

Подгруппа Oh43		Подгруппа Мо17
Линия	Q	Линия	Q
Oh43	0,989	Мо17	0,998
МС17С	0,984	АЦ17МВ	0,997
Дн2	0,981	ВК387МВ	0,997
АЦ151	0,968	МС236С	0,991
К325МВ	0,968	ДК231зС,зМ	0,785
МС48ВС	0,952	ДК370МВ	0,774

В дальнейшем в биотехнологических программах с участием зародышевой плазмы Ланкастер необходимо применять дифференцированный подход к выбору генотипов эксплантатов с учетом каллусогенного и регенерационного потенциала, выявленного нами у подплазм Oh43, Мо17/Oh43 и Мо17mix.

Для расширения числа генотипов плазмы Ланкастер, способных к формированию каллусной ткани, следует привлекать новые, коммерчески ценные линии, адаптированные к условиям степной зоны Украины, наиболее близкородственные линиям Oh43 и Мо17 по результатам SNP-анализа. Результаты оценки генетической структуры современных линий кукурузы необходимо учитывать в селекционных программах при подборе родительских компонентов гибридов для получения максимального эффекта гетерозиса как по продуктивности, так и по способности к адаптации к росту, развитию и формированию урожая в условиях недос- таточного увлажнения и жесткого температурного режима в период вегетации.

Линии кукурузы селекционной группы Ланкастер характеризуются высоким потенциалом образования основных типов каллусной ткани в культуре in vitro, тогда как их регенерационная способность находится на среднем уровне. Частота морфогенного каллусогенеза в значительной степени варьирует в зависимости от генотипа эксплантата и почвенно-климатических условий выращивания донорных растений. Наибольшую экологическую стабильность каллусогенной способности обеспечивает генетический материал подплазмы Oh43, как самостоятельно, так и при добавлении его к Мо17. Анализ однонуклеотидного полиморфизма ДНК линий кукурузы украинской селекции позволил разделить их на 5 подгрупп в зависимости от аллельного состояния SNP-маркеров и выявить новые, коммерчески ценные линии, наиболее близкие по генетической структуре к Oh43 и Мо17.

• 1.    Сатарова Т.Н., Черчель В.Ю., Черенков А.В. Кукуруза: биотехнологические и селекционные аспекты гаплоидии Днепропетровск: Новая идеология, 2013. 552 с.

• 2.    Дзюбецкий Б.В., Черчель В.Ю . Современная зародышевая плазма в селекции кукурузы в Институте зернового хозяйства УААН // Селекция и семеноводство. 2002. Вып. 86. С. 11-19.

• 3.    Деркач Е.В., Абраимова О.Е., Сатарова Т.Н. Каллусогенный потенциал линий кукурузы группы Ланкастер в условиях in vitro // Вестник ДНУ. Серия Биология. Экология. 2011. Вып.19, Т.1. С. 16-21.

• 4.    Green C.E., Phillips Y.L. Plant regeneration from tissues cultures of maize // Crop Sci. 1975. Vol. 15. Р. 417-421.

• 5.    Пиралов Г.Р., Байдак Л.А., Абраимова О.Е. Влияние нитрата серебра на каллусогенез и регенерацию растений кукурузы в культуре незрелых зародышей кукурузы

  // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. Т. 26. № 6. С. 567-572.

• 6.    URL: http:// www.biodiagnostics.net/.

• 7.    Fan J.B., Gunderson K.L., Bibikova M. et al . Illumina universal bead arrays // Methods Enzymol. 2006. V. 410. P. 5773.

• 8.    Lu Y., Yan J., Guimaräes C. T. et al. Molecular characterization of global maize breeding germplasm based on genome wide single nucleitide polymorphism // Theor. Appl. Genet. 2009. V. 120. P. 93-115.

• 9.    Ganal M W . et al. Review SNP identification in crop plants // Curr. Opin. Plant. Biol. 2009. V. 12. N 2. P. 211-217.

• 10.    Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. Inference of population structure using multilocus genotype data: linked locs and correlated allele frequencies // Genetics. 2003. V. 164. P. 1567-1587.

BIOTECHNOLOGICAL AND MOLECULAR AND GENETIC CHARACTERISTICS OF MAIZE LINES OF LANCASTER BREEDING GROUP