Биотестирование донных отложений р. Енисей с использованием водного растения Elodea canadensis

Р ека Енисей подвергается антропогенному загрязнению промышленно-коммунальным комплексом г. Красноярска и других населенных пунктов, расположенных в зоне водосбора, а также загрязнена техногенными радионуклидами в результате многолетней работы Горнохимического комбината (ГХК) РОСАТОМа, расположенного на правобережье реки, на 80 км ниже краевого центра. За время работы ГХК в донных отложениях р. Енисей накопились высокие активности долгоживущих техногенных радионуклидов [1]. Предыдущие исследования выявили повышенные концентрации некоторых тяжелых металлов в донных отложениях реки ниже Красноярска [2]. Таким образом, донные отложения р. Енисей на участке, расположенном ниже г. Красноярска и ГХК являются потенциальным источником ксенобиотиков химической и радиационной природы для биоты.

В зоне техногенного загрязнения р. Енисей наблюдается массовая вегетация макрофитов [3]. К числу доминирующих видов относится элодея канадская ( Elodea сanadensis Michx.). В результате исследований, проведенных ранее, был выявлен повышенный уровень клеток с цитогенетическими нарушениями в корневой меристеме элодеи, произрастающей в зоне радиационного за-

грязнения реки [4]. В настоящее время погруженные макрофиты ( Myriophyllum spp., Elodea spp. и другие виды) широко используются для биотестирования воды и донных отложений [5-9] наряду с луковым тестом [10].

Цель данной работы: оценить токсичность и мутагенность донных отложений р. Енисей для водных растений в лабораторных условиях, а также выявить наиболее чувствительные конечные параметры роста растений и возможную зависимость токсического эффекта от содержания радионуклидов в пробах донных отложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пробы донных отложений (ДО) отбирали в октябре 2012 года в р. Енисей на участках с разным уровнем радиационного загрязнения. Фоновая проба (ДО-1) была отобрана со стороны левого берега, на 12 км выше Красноярска. В зоне радиационного и химического загрязнения были отобраны пробы со стороны правого берега реки: ДО-2 – вблизи с. Большой Балчуг, ДО-3 – вблизи с. Атаманово и ДО-4 – вблизи устья р. Шумиха, на расстоянии 97, 86 и 80 км ниже Красноярска соответственно. Пробы ДО отбирали в местах вегетации макрофитов вблизи берега из верхнего слоя толщиной до 20 см, протирали через полиэтиленовую сеть с размером ячеек 0.9 см и хранили при 4-5 ^оС. Растения Elodea canadensis Michx. (элодея) отбирали в р. Енисей на том же фоновом участке, что и пробы ДО-1, и акклиматизировали в лаборатории в течение двух недель на водопроводной воде при температуре 18-19 ^оС и рассеянном освещении с естественным фотопериодом. Для экспериментов использовали апикальные побеги длиной 4 см, выросшие в лаборатории.

Для эксперимента брали образцы проб ДО объемом по 300 мл (массой 500-700 г) с каждой точки отбора, и измеряли в них содержание радионуклидов. Затем каждую пробу делили на три равные части и раскладывали по стеклянным стаканам. Каждую порцию ДО заливали водопроводной водой, отфильтрованной через мембраны (RAWP, Millipore) с размером пор 0.2 мкм, в пропорции 1:4 по объему, не допуская значительного взмучивания. Через сутки в ДО высаживали растения, по 9 побегов на стакан. Далее стаканы выдерживали при температуре 19 оС, круглосуточном освещении люминесцент-ными лампами с уровнем освещенности на поверхности воды 1.5 клк в течение 14 суток. По окончании эксперимента растения вынимали из ДО, измеряли все необходимые параметры, высушивали при 80 оС. В качестве параметров роста измеряли длину побегов; длину корней; число корней; массу побегов (сырую и сухую); прирост длины и массы по отношению к их начальным величинам; соотношения вышеназванных параметров.

Для исследования цитогенетических характеристик корни элодеи фиксировали в уксусном алкоголе (3 части 96%-го этанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), затем окрашивали 1% ацетогематоксилином (1 г C 16 H 14 O 6 xH 2 O (Panreac, Испания) на 100 мл 45%-ной CH 3 COOH) с добавлением 4% раствора железоаммонийных квасцов (0.1 мл на 1 мл красителя). Корешки выдерживались в этой смеси в термостате при 65 ^оС в течение 15 мин. Окрашенные кончики корней помещали на предметное стекло в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата, накрывали покровным стеклом и раздавливали апикальную меристему до равномерного распределения клеток. Полученные временные препараты просматривали сразу после их приготовления с помощью микроскопа Микмед-2 (ЛОМО, Россия) и фотографировали. В каждом препарате анализировалось не менее 100 митозов. Число исследованных корней составило для проб ДО-1 и ДО-2 – по 16 шт., ДО-4 – 14 шт., ДО-3 – 10 шт. В качестве показателей мутагенности оценивались частота встречаемости (%) клеток с хромосомными аберрациями на стадиях ана-телофазы и метафазы клеточного цикла (неравномерное расхождение, агглютинация хромосом, выбросы хромосом за пределы пластинки, отстающие и забегающие вперед хромосомы, хромосомные и хроматидные «мосты») в общем числе делящихся клеток и спектр нарушений (доля клеток с каждым типом нарушений от суммы клеток с нарушениями, %).

После удаления растений из донных отложений в конце экспериментов надосадочную воду из трех стаканов сливали, объединяли, фильтровали через бумажный фильтр с размером пор 3.5 мкм («синяя лента») и концентрировали до 40 мл с добавлением азотной кислоты при нагревании. Донные отложения из трех стаканов также объе- диняли в одну пробу. Осадок донных отложений на фильтре добавляли к пробе донных отложений. Высушенную биомассу элодеи озоляли в смеси H2O2 и HNO3 (конц.) при нагревании. Полученные пробы использовали для измерения содержания радионуклидов.

Активность радионуклидов в пробах измеряли на гамма-спектрометре с детектором из сверхчистого германия (Canberra, США), спектры анализировали с помощью программного обеспечения Genie-2000 (Canberra, CША).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание радионуклидов в пробах донных отложений, растений и воды.

В пробах донных отложений (ДО) содержался природный радионуклид 40K, удельная активность которого в исследованных образцах находилась примерно на одном уровне (Таб. 1). Из техногенных радионуклидов в фоновой пробе (ДО-1) зарегистрирована незначительная активность 137Cs. В других пробах ДО отмечен больший перечень техногенных радионуклидов (60Co, 137Сs, 152,154Eu), из которых наибольшая активность принадлежала 137Сs (48-99%). Максимальная суммарная активность техногенных радионуклидов отмечалась в пробе ДО-4 (Таб. 1). Суммарная активность гамма-излучающих радионуклидов (техногенных и природного изотопа 40К) в пробах ДО с загрязненного участка реки превышала фоновую активность в 1.5-4.8 раз. Активность техногенных радионуклидов в пробах, отобранных в зоне радиационного загрязнения, варьировала в 2-5 раз и значительно превышала фоновую.

В воде по окончании эксперимента не зарегистрировано содержания радионуклидов. Незначительная активность 137Сs (0.08±0.02 Бк/кг сухой массы) была зарегистрирована в биомассе растений, выращенных на пробе ДО-4.

Показатели роста побегов и корней

За время эксперимента длина побегов элодеи увеличилась в 2.3-2.9 раз относительно их начальной длины (рис. 1 а). Появления боковых побегов не наблюдалось. Прирост длины побегов на пробе ДО-4 был достоверно меньше (р<0.05), а на пробе ДО-1 – больше (p<0.05), чем на других пробах. Биомасса побегов элодеи возросла в 1.41.7 раз по сравнению с их начальной массой (Рис. 1 б). Минимальный прирост биомассы (p<0.05) был зарегистрирован на пробе ДО-4, величина достоверно отличалась от прироста массы на пробе ДО-2 и ДО-3. Прирост массы на пробе ДО-1 был также достоверно (p<0.05) ниже прироста на пробах ДО-2 и ДО-3.

Суммарное число корней, выросших на укорененной в ДО части побегов элодеи, составило от 14 до 25 шт., а их суммарная длина – 54.7-108.9

см. Наименьшие число и длина корней (р<0.05)

зафиксированы для пробы ДО-3 (Рис. 1 в, г).

Таблица 1. Активность радионуклидов в пробах донных отложений р. Енисей (Бк/кг сырой массы), использованных для оценки токсичности.

Изотоп	1
40K	327±21
60 Co	-
137Cs	0.8±0.2
152 Eu	-
154 Eu	-
Суммарная активность	328±21
Активность техногенных радионуклидов	0.8±0.2
*- изотоп не зарегистрирован.

Хромосомные нарушения

Доля клеток апикальной корневой меристемы элодеи, содержащих различные аномалии хромосом в ана-телофазе и метафазе клеточного цикла, варьировала в диапазоне 10.3-14.9% от общего числа делящихся клеток (Рис. 1 д). Наиболее часто клетки с отклонениями от нормы встречались в корнях элодеи, выросших на пробе ДО-4, достоверно чаще (p<0.05) по сравнению с пробами ДО-1 и ДО-2. Среди зарегистрированных аномалий по частоте встречаемости доминировали различные виды неравномерного расхождения хромосом (ассиметричное и хаотичное расхождение, выброс и запаздывание хромосом и др.) на уровне 51.367.9% от числа клеток с нарушениями (Рис. 1 е). Хроматидные и хромосомные «мосты» встречались в 2.7±2.0% клеток (средн. знач. от числа делящихся клеток ± станд. отклон, n=16) на фоновой пробе (ДО-1); в 3.5±2.1% клеток (n=16) на пробе ДО-2; в 4.1±2.0% клеток (n=10) на пробе ДО-3; в 4.9±3.2% клеток (n=14) на пробе ДО-4. Доля клеток с «мостами» в общем числе клеток с нарушениями составляла 27.8-36.2% (Рис. 1 е). В 3.7-13.5% аберрантных клеток встречались такие аномалии как агглютинация хромосом и остаточное ядро.

Зависимость параметров элодеи и активности радионуклидов в пробах ДО

Корреляционный анализ выявил обратную зависимость роста длины побегов (длины и прироста длины) элодеи от удельной активности радионуклидов (суммарной и техногенных) в пробах ДО (r2=-0.96-0.98) (Таб. 2). Частота встречаемости клеток с хромосомными нарушениями в клетках корней элодеи (r2=0.97) положительно коррелировала с активностью радионуклидов в пробах ДО (Таб. 2). Выявлена обратная зависимость между частотой встречаемости клеток с аномалиями хромосом (r2=-0.94) и длиной побегов. Частота встречаемости клеток корней, содержащих «мосты», отрицательно коррелировала с ростом длины побегов элодеи с наименьшим коэффициентом корреляции (r2=-0.72), по сравнению с вышеупо-

Номер пробы донных отложений 2 3 4 242±18 254±19 312±23 68±2 61±2 10±1 124±5 353±13 1262±45 58±2 178±3 - 7±1 24±1 - 498±27 875±39 1584±69 256±9 621±20 1272±46 мянутыми. Существенной корреляции между показателями роста корней и побегов не выявлено.

ОБСУЖДЕНИЕ

Токсичность и мутагенность ДО может быть обусловлена присутствием в них как отдельных ксенобиотиков (органических соединений, тяжелых металлов, радионуклидов и др.), так и сочетанным действием факторов различной природы. Совместное действие радиационного и химического факторов (металлов) может вызывать как усиление, так и ослабление биологических реакций [11]. Пробы донных отложений, выбранные нами для тестирования, значительно отличались по содержанию техногенных радионуклидов. Активность радионуклидов в пробах ДО отражает дозовую нагрузку на растения. Поскольку доза, формируемая природным фоном (за счет 40К), изменяется незначительно, приращение дозовой нагрузки происходит за счет присутствующих в пробах ДО техногенных радионуклидов. Расчеты, проведенные ранее, показали, что дозы облучения макрофитов в зоне радиационного загрязнения р. Енисей не превышают порогового значения мощности дозы облучения для водной биоты – 10 мГр/сут [4]. Содержание других возможных ксенобиотиков в ДО р. Енисей нами не исследовалось, поэтому пока мы можем однозначно судить только о повышенном содержании техногенных радионуклидов в исследованных пробах ДО и воздействии малых доз ионизирующего излучения.

Параметры роста водных растений отличаются по чувствительности к действию токсических факторов [6]. В наших экспериментах длина побегов элодеи и ее прирост имели обратную зависимость от удельной активности радионуклидов в пробах ДО с высокими коэффициентами корреляции (р<0.05), а прирост биомассы не согласуется с приростом длины побегов и не коррелирует с содержанием радионуклидов в пробах. Следовательно, длина побегов элодеи – более чувствительный параметр к содержанию техногенных радионуклидов в ДО, по сравнению с биомассой растения.

а * + ~ #

3 12 " 10- О 1 8 -с 6 -

* +        ~# #        * + ~ #

н

h

rh

s 4 - Ч 2-

12   3   4 Номер пробы донных отложений

5 S     л и  4 s О. 3 о и 5   2 S Ч  1 0

*

+

в

*

~

12   3   4

20 "1 S 15" 3 ^ 10 - И g 5 "

+

д

—

*

+

4 0 4

12   3   4

2.0 5 1.5 >< 1.0 S § 0.5 и 0.0	+ #			+	~	б	#	*	~ *
		т
		1
	12   3   4
			г
1 20 $ 15- о О 10 5 S    с У 5 -
0 4	12   3   4
- 100-1						е
1 g 80 3 £ 60 cd И О 40 - и о 1 20 - И а -		1 т		1	г					г
										г
		1
	12   3   4 □ мосты   □ неравн.расхожд.   В прочие

Рисунок. Параметры элодеи после выращивания растений на пробах ДО р. Енисей № 1-4, отобранных на разном удалении от источников радиационного и химического загрязнения: а - абсолютная длина побегов, см (средн. знач. ± станд. отклон., n=27), пунктиром отмечена начальная длина; б - прирост сухой массы побегов относительно начальной массы (средн. знач. ± станд. отклон., n=27), в - длина корней, см (средн. знач. для трех повторностей, по 9 растений в каждой ± станд. отклон.); г - суммарное число корней, шт.; д - доля клеток в корнях с хромосомными нарушениями (%, средн. знач. ± дов. инт. 95%), значки над столбцами (*, +, ~, #) обозначают достоверность различий (p<0.05) между отмеченными значениями; е - спектр хромосомных нарушений в клетках корней (% от числа клеток с нарушениями, средн. знач. ± дов. инт. 95%).

Показатели роста корней отмечаются как более чувствительные, чем показатели роста побегов у ряда погруженных макрофитов [6]. В наших экспериментах наибольшее число корней выросло у элодеи на фоновых пробах ДО, однако наибольшая длина корней зарегистрирована на пробе ДО, содержащей в 1.5 раз большую активность радионуклидов, чем в фоновой пробе. Наименее интенсивный рост корней (число и длина) наблюдался на пробе ДО, содержащей в 2.7 раз большую активность радионуклидов , чем в фоновой пробе. В целом можно отметить, что показатели роста корней элодеи варьируют между пробами ДО в большей степени, чем показатели роста побегов. Так, суммарная длина побегов изменяется в 1.3 раза (от 9.1 до 11.6 см), а суммарная длина корней - в 2.0 раза (от 54.7 до 108.9 см). Однако, показатели роста корней слабо коррелируют с активностью техногенных радионуклидов в пробах, а также с показателями роста побегов. Вероятно, существует специфическая чувствительность параметров роста растений к различным токсикантам.

Таблица 2. Корреляционная матрица параметров элодеи и удельной активности радионуклидов в пробах донных отложений

	2 2 и 2 И	X X н 8	И о о G S3 X X ч	X X S 2 Н V ag	X G	* 5 X О X	X	о	§ | 2 S " о ь 3 g t? «	S3 5
Бк/кг сумм.	1
Бк/кг техн.	1*	1
Длина побегов	-0.96	-0.98	1
Прирост длины побегов	-0.96	-0.98	1.00	1
Сух. масса, прирост	-0.33	-0.26	0.06	0.06	1
Длина корней сумм.	-0.26	-0.27	0.27	0.27	-0.29	1
Число корней сумм.	-0.34	-0.39	0.48	0.48	-0.62	0.86	1
Частота клеток с нарушениями хромосом, %	0.97	0.97	-0.94	-0.94	-0.20	-0.49	-0.54	0.16	1
Частота клеток с «мостами», %	0.51	0.56	-0.72	-0.72	0.49	0.05	-0.43	-0.18	0.47	1

•    корреляция достоверна для р<0.06.

Наличие в клетках корневой меристемы повышенного уровня хромосомных аномалий является показателем генотоксичности (мутагенности) ДО [10, 12]. Встречаемость клеток с аномалиями хромосом в корнях элодеи в наших экспериментах положительно коррелировала с удельной активностью радионуклидов в пробах ДО (p<0.05) и отрицательно – с показателями роста длины побегов (p<0.6). Положительная зависимость частоты аберрантных клеток в корнях тростника от дозы облучения была также получена для водоемов зоны отчуждения Чернобыльской АЭС [12]. Максимальная частота встречаемости клеток с аномалиями хромосом в наших экспериментах в 1.4 раз превышала фоновую. В природной популяции элодеи, произрастающей в зоне радиационного загрязнения р. Енисей, частота клеток с хромосомными аномалиями в 2.6-6.5 раз превышала фоновую [4], что, вероятно, можно объяснить более длительным воздействием радиационного фактора на природную популяцию, по сравнению с растениями в нашем эксперименте.

Спектр хромосомных нарушений в наших экспериментах был сходным со спектром нарушений в природной популяции элодеи, за исключением присутствия кольцевых структур, отмеченных в клетках корней природной популяции из зоны радиационного загрязнения [4]. Кольцевые структуры в лимфоцитах человека считаются специфическими маркерами радиационного воздействия [13, 14]. Значительного изменения спектра хромосомных аномалий в наших экспериментах не наблюдалось (Рис. 1 е). Среди зарегистрированных нами нарушений хромосом преобладали различные типы неравномерного расхождения (Рис. 1 е), на втором месте по частоте встречаемости находились «мосты». Существует мнение [12], что основной причиной возникновения «мостов» в корнях водных растений является радиационный фактор, в то время как основная причина фрагментации хромосом – действие химических факторов. Частота клеток с «мостами» в наших экспериментах варьировала от 2.7 до 4.9% и положительно коррелировала с активностью радионуклидов в пробах ДО (p<0.3). Для сравнения, в природной популяции элодеи из р. Енисей «мосты» встречались в 0.5-10.3% делящихся клеток [4]. Доля клеток с «мостами» в корнях тростника обыкновенного в водоемах зоны отчуждения ЧАЭС достигала 8% без учета «мостов» в клетках с множественными аберрациями [12]. Возможно, не совсем корректно сравнивать частоту аберрантных клеток у водных растений, относящихся к разным экологическим группам: погруженным (элодея) и воздушно-водным (тростник) растениям. Установлено, что показатели роста разных видов погруженных макрофитов проявляют различную чувствительность к одним и тем же токсикантам [6]. Однако нам пока не удалось найти опубликованных результатов цитогенетических исследований погруженных макрофитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате биотестирования проб донных отложений (ДО) р. Енисей, отличающихся по содержанию техногенных радионуклидов, с использованием водного растения Elodea сnadensis (элодея) выявлена обратная зависимость роста длины побегов элодеи и прямая зависимость встречаемости клеток с хромосомными нарушениями в апикальной меристеме корней элодеи от активности техногенных радионуклидов в пробах ДО. Из исследованных показателей роста элодеи, наибольшая вариабельность отмечена для показателей роста корней, однако, рост корней не коррелировал с активностью радионуклидов в пробах ДО. На основе полученных результатов можно заключить, что длина побегов и встречаемость клеток с хромосомными аномалиями в корнях являются наиболее чувствительными показателями элодеи к воздействию радиационного фактора и могут быть использованы для оценки воздействия малых доз ионизирующего излучения при биотестировании донных отложений р. Енисей.