Биотрансформация арилалкильных сульфидов целыми клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66

Интерес к оптически активным сульфоксидам обусловлен высокой реакционной способностью и возможностью последующего удаления медиаторов, включающих фрагмент RS→O, в реакциях циклоприсоединения, альдольной конденсации, присоединения по Михаэлю и др. (Альфонсов и др., 1998). Данный подход позволяет осуществлять на основе хемо-, регио- и стереоселективных превращений сульфинильных интермедиатов синтез молекул практически любого класса органических соединений. Кроме того, некоторые сульфоксиды проявляют биологическую активность, определяющую полезные свойства таких растений как лук, чеснок, горчица и др. (Fernandez et al, 2003). Среди современных противоязвенных средств к наиболее эффективным блокаторам протонной помпы относится ( S )-сульфоксид омепразола – эзомепразол (Cotton et al, 2000; Andersson et al, 2001).

Наряду с металлокомплексным катализом для направленного окисления прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды используют метод биокаталитической трансформации. При этом в качестве катализаторов процесса сульфоксидирования применяются как индивидуальные ферменты, так и целые микробные клетки. Описаны единичные работы (Holland et al, 1992; Porto et al, 2002), в которых для повышения эффективности процесса окисления прохиральных сульфидов применяется широко используемый в биотехнологии прием иммобилизации целых клеток мицелиальных грибов. Основные проблемы, возникающие в процессе разработки таких биокатализаторов – сохранение жизнеспособности и функциональной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов. С этой точки зрения, наиболее эффективным представляется использование криогелей, обеспечивающих проведение иммобилизации бактериальных клеток при физиологических значениях pH, температуры без применения токсичных химических веществ (Лозинский, 1998).

Многие микроорганизмы в природе склонны к образованию агрегированных форм в виде хлопьев и биопленок. Так, среди бактерий выраженной способностью к кооперации отличаются представители рода Rhodococcus , самоиммобилизация которых в условиях индуцированного алканотроф-ного типа метаболизма способствует адаптации микробных клеток к экстремальным условиям обитания. Подобные адаптивные механизмы позволяют эффективно использовать родококки в биотехнологических целях, в том числе в процессах биотрансформации органических соединений (Ившина и др., 2007).

Цель настоящей работы – оценка способности иммобилизованных клеток родококков к окислительной биоконверсии арилалкилсульфидов.

В работе использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (акроним коллекции ИЭГМ; Каталог штаммов.., 1994; .

Биотрансформацию арилалкилсульфидов (0.5– 1.5 г/л) свободными и иммобилизованными клетками родококков проводили в минеральной среде следующего состава, г/л: KNO3 – 1.0; K2HPO4 – 1.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 1.0; MgSO4x7H2O – 0.2; CaCl2x2H2O – 0.02; FeCl3 – 0.001; дрожжевой экстракт – 0.1%; раствор микроэлементов по Постгейту – 1.0 мл/л; 0.1, 0.5 или 1.0 об.% н -гексадекана в качестве источника углерода и энергии. В качестве посевного материала использовали 1 мл 2 сут биомассы родококков (5.0±0.4×10⁶ кл/мл), выращенных на мясопептонном агаре и отобранных в экспоненциальной фазе роста, или 200 гранул иммобилизованных клеток (5.0±0.6×10⁶ клеток) на 100 мл среды.

В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС). В работе применяли ПВС марки 40/2 (ГОСТ 10779-78) производства ПО «Азот» (Невинномысск, Россия). Иммобилизацию родококков осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС согласно методике, описанной в работе (Kuyukina et al , 2006). Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0.5% р-ре NaCl в течение 24

ч.

Бактериальные клетки выращивали в условиях периодического культивирования в колбах Эрлен-мейера с объемом питательной среды 100 мл на орбитальном шейкере Certomat/S (160 об/мин) при 28°С.

Коммерчески доступные фенилметиловый ( Iа ), фенилэтиловый ( Iб ) и пара -толилметиловый ( Iв ) сульфиды в виде раствора в изопропаноле (1:10) добавляли одновременно или через 2 сут культивирования бактериальных клеток. При этом продолжительность процесса биотрансформации ро-дококками составляла 1–12 сут.

Продукты биотрансформации тиоанизола экстрагировали этилацетатом. Объединенные этилаце- татные вытяжки сушили над сульфатом натрия. Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя «Heidolph» (Германия). Качественный состав продуктов биотрансформации контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах с флуоресцентной добавкой фирмы «Sigma-Aldrich» (США), фиксируя образование продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными сульфидами и соответствующими сульфоксидами, полученными методом химического окисления.

Анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N с кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора. Оптическое вращение растворов образцов арилалкилсульфоксидов измеряли на поляриметре фирмы «Perkin-Elmer» (США) модель 341 при длине волны 589 нм. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле фирмы «Merck» (США) (0.06–0.20 мм), соотношение вещества и сорбента ≈ 1 : 12, в качестве элюента использовали смесь гексана с возрастающим от 5 до 40% содержанием этилацетата.

Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью компьютерных программ Exel 2000 и Statistica (версия 6.0 для Windows).

Прием индукции оксигеназных ферментных систем родококков углеводородными субстратами широко используется в процессе биотрансформации органических соединений различных классов, в том числе органических прохиральных сульфидов (Ohta et al, 1984, 1985; Гришко и др. 2000, 2009). Ранее нами было показано (Гришко и др., 2004), что в присутствии 1 об.% н -гексадекана свободные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 трансформируют фенилметиловый сульфид ( Iа ) (тиоанизол) в оптически активный ( S )-сульфоксид ( IIа ) (содержание в сумме продуктов реакции 55%) за 7 сут при условии добавления сульфида через 2-е сут инкубации родококков (рис. 1, 2).

а R 1 =H, R 2 =CH 3

б R 1 =H, R 2 =C 2 H 5

в R₁=R₂=CH₃

Рис. 1 . Биотрансформация арилалкилсульфидов R. rhodochrous ИЭГМ 66

Рис. 2 . Биотрансформация тиоанизола ( Ia ) (0.5 г/л) свободными клетками родококков в присутствии н -гексадекана в концентрации, об. %:

1 – 0.1; 2 – 0.5; 3 – 1.0

Установлено, что существенное влияние на каталитическую активность оксигеназных ферментов R. rhodochrous ИЭГМ 66 в отношении тиоанизола оказывает концентрация н-гексадекана в ростовой среде. Как видно из рис. 2, снижение содержания н-гексадекана до 0.5 об. % приводит к увеличению сульфидокисляющей активности родо-кокков и, как следствие, повышению содержания сульфоксида (IIа) до 68% в сумме продуктов биотрансформации. Полная конверсия тиоанизола (Iа) в соответствующий сульфоксид (IIа) достигается в присутствии 0.1 об. % н-гексадекана, что позволяет сократить продолжительность трансформации тиоанизола до 6-ти сут при условии добавления сульфида через 2-е сут инкубации родококков.

В то же время при повышении концентрации тиоанизола биокаталитическая активность родо-кокков заметно ингибируется. Так, при внесении 1.0 или 1.5 г/л тиоанизола уровень биоконверсии сульфида ( Iа ) составляет не более 25%, при увеличении продолжительности инкубации до 12 сут – не превышает 50%.

Для оптимизации процесса биоконверсии тиоанизола ( Iа ) использовали прием иммобилизации клеток родококков в криогель на основе ПВС. По данным хромато-масс-спектрометрии, полная биоконверсия тиоанизола (0.5 г/л) в целевой сульфоксид достигается при использовании иммобилизованных бактериальных клеток, предварительно выращенных в присутствии н -гексадекана. Установлено, что при использовании гранул биокатализатора, содержащих 0.1 об.% н -гексадекана, уже через 1 сут регистрируется образование в среде целевого сульфоксида ( IIа ) и сульфона ( IIIа ) тиоанизола в соотношении 3:1 (табл. 1).

Таблица 1

Биотрансформация тиоанизола (Iа) иммобилизованными клетками родококков

Соединение	Содержание в сумме продуктов реакции (%)*
	А			Б			В
	1 сут	2 сут	3 сут	1 сут	2 сут	3 сут	1 сут	2 сут	3 сут
Тиоанизол ( Ia )	-	-	-	73.6	-	-	94.1	18.0	-
Сульфоксид ( IIa )	74.7	34.3	13.3	26.4	55.9	28.3	5.9	78.3	41.2
Сульфон ( IIIa )	25.3	65.7	86.7	-	44.1	71.7	-	3.7	58.8

* При концентрации тиоанизола ( Iа ) в среде: А – 0.5, Б – 1.0, В – 1.5 г/л.

Достигнутая благодаря использованию иммобилизованных клеток интенсификация окислительного процесса позволила использовать более высокие концентрации сульфидного субстрата. По данным хромато-масс-спектрометрии, иммобилизованные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 при добавлении тиоанизола ( Iа ) в концентрации 1.0 и 1.5 г/л катализируют активное окисление образующегося сульфоксида ( IIа ) в сульфон ( IIIа ) уже в течение первых суток. Как следствие, на момент полного исчезновения тиоанизола через 2-3-е сут концентрация побочного сульфона ( IIIа ) составляет 44.1 и 58.8 % соответственно ( см . табл. 1).

На следующем этапе исследовали ферментативную активность иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в отношении арилалкильных гомологов тиоанизола – фенилэтилового (Iб) и пара-толилметилового (Iв) сульфидов. Установлено, что родококки при добавлении сульфидов (Iб, Iв) в концентрации 1.5 г/л, как и в модельных экспериментах с тиоанизолом (Iа), катализируют образование соответствующих (S)- сульфоксидов (IIб, IIв). Однако, показатель оптической чистоты арилалкилсульфоксидов (IIб, IIв) уступает таковому сульфоксида тиоанизола (IIа). Энантиомерный избыток (ее) (S)-сульфоксидов (IIб, IIв) составляет 54.7 и 48.0 %, соответственно. Как видно из табл. 2, при окислении арилалкил-сульфидов (Iа, Iб, Iв) параллельно с процессом образования сульфоксидов (IIа, IIб, IIв) регистрируется накопление побочных продуктов окисления – сульфонов (IIIа, IIIб, IIIв), сопровождающееся снижением эффективности процесса направленного синтеза целевых сульфоксидов (IIа, IIб, IIв), химический выход которых не превышает 30%. На наш взгляд, решение проблемы ингибирования сульфоноокисляющей активности родококков позволит сместить направление процесса окислительной биотрансформации в сторону направленного образования целевого продукта и повышения его оптической чистоты.

Таблица 2

Биотрансформация арилалкилсульфидов (Iа, Iб, Iв) иммобилизованными клетками родококков

Сульфид	Содержание (%) продуктов биотрансформации			Химический выход (%), ее (%) и [α]D ( S )-сульфоксида ( II )
	( I )	( II )	( III )
Тиоанизол ( Iа )	0.0	41.2	58.8	27.5; 82.1; -134 ( c 0.4; CHCl3)
Фенилэтилсульфид ( Iб )	0.0	43.6	56.4	28.4; 54.7; -116 ( c 0.3; EtOH)
пара -Толилметилсульфид ( Iв )	9.8	40.3	49.9	29.6; 48.0; -86 ( c 0.4; CHCl3)

Таким образом, полученные в результате проведенных исследований данные свидетельствуют о значительном повышении сульфидокислительной активности целых клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 при включении их суспензии в ПВС-криогель. Установлено, что использование иммобилизованной формы биокатализатора позволяет осуществить конверсию арилалкилсульфидов в концентрациях (>0.5 г/л), токсичных для свободных клеток родо-кокков, и сократить продолжительность процесса биотрансформации до 3 сут. О высоком окислительном потенциале родококков свидетельствует активность полученного биокатализатора в отношении образующихся в процессе биотрансформации арилалкилсульфоксидов, ингибирование процесса окисления которых в соответствующие сульфоны может способствовать повышению продуктивности процесса образования целевых сульфоксидов.

Работа поддержана грантами Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие».