Благополучие животных и количественная изменчивость элементов микробиоты

Поверхности и внутренние полости тела многоклеточных организмов населены огромным количеством микроорганизмов [16], которые взаимодействуют между собой, объединены в сообщества и упорядоченно изменяются в зависимости от состояния организма хозяина. Сообщества микроорганизмов включают комменсальные, симбиотические и патогенные формы, совокупность которых называют микробиотой. Численность и состав микробиоты регулируются гормонами стресса и эндогенными антимикробными пептидами, т. е. тесно связана с состоянием организма хозяина [15]. Изменение микробиоты включает качественные (смену видового состава) и количественные (изменение численности) перестройки. Здоровье и болезнь человека невозможно понять без полного понимания «симбиоза макроорганизма и микробиоты как суперорганизма» [18].

Kоличество микроорганизмов — обитателей слизистых и кожи на порядок превышает число клеток человека [20]. Значительная часть микроорганизмов является обитателями кожных покровов, что требует рассматривать их как часть иммунной системы [14; 17]. Поверхностная микрофлора может рассматриваться как единый маркер множественных отклонений состояния макроорганизма [4]. Одним из важнейших факторов, влияющих на динамику численности нормальных кожных бактерий и их замещение патогенными формами, как внутри тела, так и на покровах, является генерализованный адаптационный синдром — стресс [9]. При заболевании или развитии стресса, нередко еще до появления клинических признаков заболевания, изменяется состав микробиоты, прежде всего? возрастает количество нормальных кожных бактерий [1].

Целью нашей работы является изучение динамики микробиоты у животных с разным уровнем благополучия на примере борзых собак. Использована оценка количественных изменений элементов микрофлоры мочки носа — эта часть тела у большинства млекопитающих лишена волос и удобна для получения проб [9].

Материал и методы. Работу проводили с 2012 по 2015 г. Применяли стандартную методику. Метод был успешно апробирован в работах [6; 7; 8; 9], продолжает использоваться в современных работах [9; 10].

Материалом для исследований служили отпечатки на МПА (мясопептонный агар) с мочки носа собак. Для приготовления проб замороженный (предварительно стерилизованный) МПА разогревали на водяной бане. Обжигая пламенем горелки горло сосуда, разливали МПА в чашки Петри. Остужали и слегка подсушивали под УФ-лампой. Перед взятием проб маркировали чашки, указывая дату и кличку собаки.

Для получения отпечатков чашки с застывшим МПА прикладывали к носам собак (чашка открыта 5–15 с). На время сбора проб открытую чашку со средой оставляли в вольере (далее контроль воздуха, седиментационный метод, МУ 2.1.4.1057-01), она оставалась открыта более 10 минут, т. е. примерно на два порядка длительнее.

Пробы помещали в термостат, предварительно разогрев его до температуры +37 оС. Инкубировали 48 часов при t+37 оС, потом производили подсчет глазомерно колониеобразующих единиц, от 1 до 300 (согласно нормам Минздрава). Также производили фотосъемку проб.

Общепринятым методом оценки изменений количества микрофлоры является характеристика колониеобразующих единиц — КОЕ (в англоязычной литературе CFU — Сolony Forming Units). Колониеобразующая единица — это одна микробная клетка, из которой вырастает колония, т. е. жизнеспособный микроорганизм, который при инкубации в питательной среде, воспроизводясь, может сформировать колонию. КОЕ характеризует количество микрофлоры. В норме оно больше нуля, но, например, применение антибиотиков может приводить не только к сокращению численности, но и к полному исчезновению микроорганизмов. Увеличение КОЕ свидетельствует о возросшей биомассе микрофлоры поверхностей тела. Для оценки КОЕ мы применяли подсчет числа колоний на чашку.

Статистическая обработка включала сравнение Descriptive statistic и оценку значимости различий пар признаков по критерию Стьюдента в программе Statistica 8.0.

Объектом исследований служили борзые трех пород — псовые, хортые и грейхаунды, принадлежащие 4 питомникам и частным лицам. У собак частных лиц пробы собраны во время крупнейшего мероприятия по оценке рабочих качеств — на всероссийских состязаниях борзых, куда допускаются отобранные собаки, находящиеся, по мнению владельцев, в безупречной физической форме.

Благополучными (условно здоровыми) считали собак с обычной двигательной, пищевой и игровой активностью, при отсутствии клинических признаков заболеваний. Неблагополучными считали животных с установленными хроническими или острыми болезнями, травмами, краткосрочными диспепсиями, аномальными линьками, либо аномально сниженной активностью.

Результаты и их обсуждение. Микробиологический анализ показал, что состав бактерий поверхности носа представлен разными видами родов Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Lactobacillus , встречаются дрожжеподобные грибы рода Candida (табл. 1). Данные соответствуют анализу, проведенному ранее [9].

Общие результаты проведенных работ

№	Название выборки	Величина выборки	КОЕ среднее	КОЕ Дов. инт
1	Пробы всех собак	427	154,0	145,0±163,0
2	Контроль воздуха	25	10,0	14,2 ± 25,4
3	Питомник ИПЭЭ-РАН	310	152,0	141,5± 162,1
4	Иные (3 питомника и состязания)	96	157,0	138,3 ±175,4
5	Зима (снеговой покров, -27гр С< T >+2 гр С)	50	123,0	104,5± 141,3
6	Лето (+18 гр С< T >+30 гр С)	137	108,0	96,7 ± 119,2
7	Возраст от 1года до 8 лет	276	125,0	116,0±134,3
8	Возраст до 1 года и после 8 лет	35	186,0	154,4±217,1
9	Все кобели	113	128,0	72,0±93,1
10	Все суки	163	123,0	70,0±87,0
11	Благополучные	276	125,0	116,0±134,3
12	Неблагополучные	83	230	213,0±247,0

Качественный состав микроорганизмов в пробах, % (выполнен в независимой лаборатории ШАНС-БИО)

Таблица 1

Вид	Sta. epidermidis	Sta. aureus	Enter. faecium	Sta. intermedius	Lac + E.colii	Candida albicans
Частота встречаемости	77,8	55,6	38,8	33,3	27,7	22,2

Сравнение количества микроорганизмов контроля воздуха с пробами всех собак показывает наличие значимых (p<0,0001) различий. Следовательно, присутствие микрофлоры на мочке носа собак обусловлено не контаминацией из воздуха.

Таблица 2

Полученные данные свидетельствуют о том, что количество микрофлоры не различается у борзых четырех питомников, находящихся в разных регионах и климатических условиях.

Считается, что в летнее время условия внешней среды более благоприятны для развития микроорганизмов, что могло влиять на количество микроорганизмов в пробах у собак. Наши исследования не подтвердили этого. Независимо от температуры внешней среды количество микроорганизмов в пробах не различается (р=0,84). Это доказывает, что развитие микрофлоры поверхности тела контролируют в большей степени эндогенные факторы (состояние организма), нежели экзогенные (окружающая среда).

Принято считать, что у собак в возрасте до 1 года неустойчивая иммунная система, а животные старше 8 лет могут иметь ослабленный иммунитет [3]. Следовало оценить, есть ли различия между такими животными. С этой целью из общей выборки были отобраны молодые собаки до года (n=1) и пожилые от 8 до 10 лет (n=14).

Данные, представленные на рис. 1, показывают, что количество микрофлоры у молодых и пожилых собак значимо (р≤0,0001) выше, чем у собак от года до 8 лет (табл. 2). Это соответствует положению об ослаблении иммунитета и более низкой стресс-резистентности молодых и старых животных [2; 12]. Учитывая эти результаты, данные по молодым и старым собакам не использовали в дальнейшем анализе.

до 1 года и от 8 лет vs. от 1 до 8

□ Mean □ Mean±SE I Mean±1,96*SE

до 1 года и от 8 лет    от 1 до 8

Рис. 1. Возрастная изменчивость

По оси ординат — кол-во колоний, по оси абсцисс — названия выборок. Mean-среднее, SD-доверительный интервал, 1,96SD — величина дисперсии

Анализ гендерной изменчивости (табл. 2, п. 9–10) количества микрофлоры показал отсутствие значимых различий (р=0,6).

Существуют данные о том, что состав и количество микроорганизмов у людей и животных меняются в зависимости от их состояния [9,12]. К неблагополучным были отнесены 29 животных с травмами (n=9), диспепсией, стрессом (n=12), кожные воспаления (n=2) и различные болезни (n=8), ложная беременность (n=2).

Клин.здоровые

Неблагополучные

Рис. 2. Результаты сравнения животных в разном состоянии

Количество микроорганизмов, обнаруженных на мочке носа неблагополучных животных почти вдвое выше, чем у здоровых (табл. 2): среднее значение КОЕ у здоровых собак ниже, чем у неблагополучных, а дисперсия — существенно больше.

Заключение

Из представленных данных видно, что повышенное количество микроорганизмов значимо чаще встречается у неблагополучных собак и является признаком снижения благополучия. Это свидетельствует о том, что количество микрофлоры мочки носа определяется эндогенными факторами, т. е. общим благополучием организма, что соответствует данным [13] о том, что стрессоры повышают число особей с большим количеством колоний бактерий. При любом заболевании развивается генерализованный адаптационный синдром, т. е. животные с повышенным количеством микроорганизмов на поверхности кожи пребывают в состоянии длительного стресса. Стресс — это не только состояние организма, но и механизм регуляции количественного и качественного состава микрофлоры, населяющей любой макроорганизм. Выброс адреналина является пусковым механизмом процессов, нарушающих стабильность кожных микробных ассоциаций [5].

Таким образом, сравнение количества кожных микроорганизмов можно рекомендовать для характеристики благополучия животных в качестве неинвазивного метода оценки их состояния.