Блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов в послеоперационном периоде уролитиаза

Мочекаменная болезнь является актуальной проблемой хирургической урологии, ежегодно на территории Российской Федерации производится порядка 200 тысяч операций. Оптимизация существующих методов оперативных вмешательств, внедрение лапароскопических и лазерных технологий приводит к усовершенствованию методик лечения уролитиаза. Однако, послеоперационные осложнения сохраняются на прежнем уровне и достигают 15% [1-4].

Осложненное течение послеоперационного периода сопровождается изменениями гомеостаза, связанными с активацией иммунитета и дисрегуляцией эндотелиальной системы. В оценке выраженности иммунной и эндотелиальной дисфункции очень важно учитывать состояние лимфоцитов, и в частности феномен блеббинга плазматической мембраны и наличие мембран высвобожденных микрочастиц в крови, как следствие терминального блебинга, а также активацию рецепторов клетками, входящими в состав крови и эндотелиоцитами [5,6].

Зачастую блеббинг оценивается как повреждение плазматической мембраны, приводящей к гибели клетки во время процессов некроптоза и апоптоза и является результатом сигналов, происходящих внутриклеточно. Однако,операционный стресс и осложненное течение послеоперационного периода, за счет бактериальных токсинов и биологически активных веществ могут оказывать внешнее повреждение плазматической мембраны. Для предотвращения гибели плазматическая мембрана обладает внутренней способностью к восстановлению, за счет активации кальцием липидной скрем-блазы.Этот процесс сопровождается увеличением пор мембраны, образованием внеклеточных блебб, с сохранением целостности мембраны и повышением жизнеспособности клеток [7-9].

Адаптивный иммунитет реализуется способностью лимфоцита к перемещению внутри лимфоидных органов и из них, который зависит от функции регуляторных белков цитоскелета. Так белки семейства ERM образуют регулируемую связь между плазматической мембраной и актиновой корой, однако активные производные ERM приводят к нарушению цитоскелетных реакций и дисре-гуляции транспорта лимфоцита.Известно,что при отсутствии белков семейства ERM происходит поляризация лимфоцитов, миграция и хемотаксис, таким образом остается спорным вопрос о физиологической роли белков ERM на лимфоцит. В экспериментальных работах на лабораторных мышах было выявлено, что белки ERM оказывают значимое влияние на Т-клетки при выходе из лимфоидных органов; данный процесс управляется сигнальным липидом сфингозин-1-фосфатом. Сфингозин-1-фосфат приводит к другому режиму миграции, отличающемуся от индуцированного белковыми хемо-кинами. В ходе миграции, индуцированной хемокинами клетки используют выступы, содержащие актин, сфин-гозин-1-фосфат, что оказывает влияние на внутриклеточное давление с образованием блеб на мембране создавая подвижность. Белки ERM играют важную роль в миграции на основе блеббинга плазматической мембраны в ответ на сфингозин-1-фосфат [10].

Таким образом, блеббинг плазматической мембраны лимфоцита – это процесс жизнедеятельности клетки, приводящий к взаимодействию самой мембраны с белками цитоскелета. Дисбаланс взаимодействий между цитоскелетом и окислительными,биохимическими реакциями в мембранах клеток при снижении активности многих ферментов, в том числе протеаз, которые приводят к изменению электролитного баланса плазматической мембраны клетки, приводит к ее пузырению и последующему терминальному блебингу, что является необратимым процессом, высвобождается большое количество биологически активных веществ (микровезикул), имеющих антигенную активность, что приводит к повреждению сосудистой стенки и запуску развития эндотелиальной дисфункции [8, 11].

Цель

Оценить,в какой фазе блеббинга (начального или терминального) находится плазматическая мембрана лимфоцитов у пациентов с осложненным послеоперационным периодом.

Материалы и методы

В исследование вошли 240 пациентов, которые проходили лечение в урологическом отделении Клинической больницы ЧУЗ «РЖД-Медицина» г. Красноярск в период с 2017 по 2019 гг. которым были проведены эндоскопические и малоинвазивные вмешательства по поводу мочекаменной болезни.Для сравнения и статистической обработки данных были выделены две клинические группы пациентов: I группа (n=130), в этой группе осложнений не было, II группа (n=110) - пациенты с осложненным течением послеоперационного периода.

В исследовании принимало участие 98 (40,8%) женщин и 142 (59,2%) мужчин. Средний возраст пациентов составил 71 (69; 72) год, для женщин 73 (70; 76) года, для мужчин 67 (65; 70) лет.

Для исследования была создана контрольная группа из 25 человек, по возрасту и полу сопоставимая с исследуемой группой.

В НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России проводилось исследование феномена блеббинга плазматической мембраны лимфоцита по стандартному методу: проводилось центрифугирование крови обследуемого пациента в градиенте плотности с Lympholyte H CL5010 «Cedarlane Laboratories Limited», выделялись лимфоциты, оценивалось состояние мембраны клетки методом фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Olympus BX–41). На рисунке 1 представлен лимфоцит в состоянии терминального блеббинга.

Полученные в ходе статистического анализа данные представлены в виде медианы, 25; 75 перцентилей Ме [Q1; Q3], а характер распределения полученных величин оценивался согласно теста Шапиро-Уилка. Многие величины не соответствовали нормальному распределению, для попарного сравнения в группе приходилось применять непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Критическим уровнем, статистической значимости при проверке нулевой гипотезы, считали коэффициент равным 0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования были выявлены лимфоциты с разной степенью выраженности изменений в плазматической мембране, от начального и до терминального блеббинга. Максимальное количество изменений в плазматической мембране лимфоцитов встречалось у пациентов с развившемся в послеоперационном периоде осложнениями и составила 15,92 [13,20; 17,01] при оценке начального блеббинга и 21,93 [17,67; 30,45] для терминального блеб-бинга. При благоприятном течении послеоперационного периода у пациентов с уролитиазом не происходило статистически значимых изменений в показателях блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов (рис. 2).

Рис. 1. Лимфоцит крови в состоянии терминального блеббинга (слева – фазово-контрастная микроскопия на флуоресцентном микроскопе, в центре и справа – конфокальная микроскопия)

Fig. 1. The mechanism of formation of spastic pelvic floor paresis in patients with AP. The figure shows: 1-neck of the bladder, stretched by hypertroA blood lymphocyte in a state of terminal blebbing (on the left - phase contrast microscopy on a fluorescent microscope, in the center and on the right - confocal microscopy)

Рис. 2. Показатели состояния плазматической мембраны лимфоцитов у пациентов МКБ

Fig. 2. Indicators of the state of the plasma membrane of lymphocytes in patients with KSD

Одной из функциональных способностей лимфоцита является миграция. Т-клетки непрерывно циркулируют между кровотоком, органами и тканями организма, данный механизм обеспечивается скелетом актомиозина. Вторым, менее активным механизмом миграции является блеббинг, в основном генерируемый на переднем плане. Таким образом, состояние начального блеббинга является важным механизмом функциональной активности и цитотоксичности лимфоцитов.

Патогенетическое значение феномена блеббинга плазматической мембраны заключается не только в разрушении клетки, но и выходом свободных микрочастиц, по сути, обрывками клеточной мембраны, в межклеточное пространство, которые затем участвуют, в межклеточном взаимодействии инициируя воспалительную реакцию. При обработке полученных данных, было выявлено, что в I клинической группе наличие свободных микрочастиц не отличалось от показателей обследованных пациентов в контрольной группе, а у пациентов II клинической группы составило 1318 [982; 2007] циркулирующих микрочастиц, что значимо превышало аналогичные показатели, чем в контрольной группы (таб. 1).

Развитие стресса сопровождается разрушением плазматической мембраны клетки, также этот процесс вызывают патогены, секретирующие токсины и фосфолипазы и получая доступ к клеткам-хозяевам. В то время иммунная система направлена на уничтожение как патогена, так и патоген-инвазированных клеток. В ходе данного процесса происходит приток внеклеточного Ca2+, вызывая повреждение фосфолипидного бислоя и цитоскелета. В дальнейшем запускается процесс блеббинга плазматической мембраны,как раннего маркера гибели клетки. Блеббинг образуется вследствие всплеска цитоплазмы, повышения гидростатического давления и затем формирования грыж плазматической мембраны. Активация миозина, перестройка цитоскелетных структур, вызванная Ca2+ – зависимыми или Ca2+ – независимыми механизмами приводит к блеббингу цитоплазматической мембраны.Несмотря на то,что блеббинг чаще связан с процессами повреждения клеток и апоптозом, он также проявляется в цитокинезе и локомоции клеток. Также известна роль блеббинга в механизме устойчивости к плазмалеммальному повреждению, в качестве так называемой ловушки для поврежденного сегмента мембраны и прилегающего к нему цитозоля. При повреждении плазмалеммы потеря внутриклеточных компонентов будет ограничена зоной блеббинга, запечатанные блебы служат поглотителями потенциально повреждающего Ca2+ и предотвращают протеолиз и липолиз внутри клетки [6, 8].

Блеббинг плазматической мембраны лимфоцитов, формирование микрочастиц различного клеточного происхождения представляется перспективным направлением для исследования патогенеза развития и прогрессирования воспалительной реакции. Полученные в проведенном исследовании данные согласуются с результатами, опубликованными в научных изданиях. В ходе воспалительной реакции происходит возрастание преапоптических процессов в лимфоцитах, что может объясняться участием лимфоцитов в реализации механизмов воспаления и иммунного ответа. Под итожив результаты обследования мы наблюдаем тот факт, что для развития процесса обратимого блеббинга большое влияние оказывают ранее запущенные механизмы, которые активируют лимфоциты и приводят к местной примембраной электролитной диссинергии протеолитических ферментов клетки. Интенсивность реакции блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов можно рассматривать как интегральный показатель активации иммунокомпетентых клеток при развитии воспалительного процесса [9, 11].

Показатели состояния плазматической мембраны лимфоцитов у пациентов с уролитиазомIndicators of the state of the plasma membrane of lymphocytes in patients with urolithiasis

Таблица 1.

Tab le 1.

Показатель Контрольная группа 1 группа(n=130) II группа (n=110) Циркулирующие микрочастицы лимфоцитарного происхождения в пересчете на 100 лимфоцитов 386 [200; 453] 412 [350; 588] p = 0,479 1318 [982; 2007] p <0,001 p1<0,001 p – различие с группой контроля.

p1 – достоверность различия с показателями группы пациентов с бактериурией, при неинфицированных конкрементах

Заключение

Из выше изложенного следует, что в результате физиологических процессов в лимфоците,активируется процесс повышающий давление внутри клетки, что порой приводит к необратимому процессу, с нарушением цитоскелета лимфоцита и «пузырением» мембраны, у пациентов с уролитиазом в послеоперационном периоде.

Установлена зависимость между фазой активности терминального блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов и возможными проявлениями осложнений в послеоперационном периоде у пациентов с мочекаменной болезнью.Регистрация интенсивности блеббинга и мембран высвобожденных микрочастиц с индентифика-цией их субпопуляции является важным критерием в прогнозе развития осложнений послеоперационного периода.