Ca2 + -зависимая аденилатциклаза растительных клеток в бактериальном патогенезе

В настоящее время ионы кальция признаны универсальными посредниками в клеточных реакциях организмов растений и животных. Именно ионы кальция в цитозоле служат связующим звеном для многих сигнальных путей, обеспечивая формирование сигнальной сети растительной клетки (Guo et al. , 2018). Передача стрессовых сигналов с участием Ca²⁺ происходит благодаря его способности дифференцированно взаимодействовать с клеточными белками, в том числе с ферментами, которые являются ключевыми звеньями в других сигнальных системах растений (Hepler, 2005).

На клетках животных показано, что аденилатциклазная и кальциевая сигнальные системы активно реагируют на стрессоры разной природы (Cao et al. , 2017), при этом тесно взаимодействуя между собой. У растений исследования по взаимному влиянию сигнальных систем менее многочисленны, чем таковые у животных. Пока в клетках растений выявлены только неселективные, регулируемые нуклеотидами кальциевые каналы, активация которых происходит при присоединении цАМФ (Chin et al. , 2009). У животных давно выявлены изоформы аденилатциклазы, фермента, синтезирующего цАМФ, отличающиеся по чувствительности к ионам кальция (Halls, Cooper, 2011). Для растений такие сведения единичны (Chatukuta et al. , 2018), что значительно осложняет понимание путей трансдукции сигналов, происходящих в растительных клетках на ранних этапах воздействия стрессоров. Цель настоящей работы – исследовать изменение чувствительности к экзогенным ионам Ca²⁺ трансмембранной аденилатциклазы (тмАЦ) из клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к бактериальному возбудителю кольцевой гнили Clavibacter michiganensis ssp. s epedonicus ( Cms ), при действии экзополисахаридов (ЭПС) Cms.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали растения картофеля ( Solanum tuberosum L . ) сорта Луговской

(резистентный к Cms), сорта Лукьяновский (чувствительный к Cms) и ЭПС Cms вирулентного, мукоидного штамма 5369. Экзополисахариды Cms добавляли в жидкую среду роста растений и инкубировали в течение 1 мин. Пробоподготовку для выделения тмАЦ проводили по стандартной схеме, описанной в (Ломоватская и др., 2015). Кальций добавляли к выделенному ферменту в виде CaCl2 (ч.д.а., “Реахим”, Россия) в следующих конечных концентрациях: 500 нМ, 1мкМ, 500 мкМ, 1 и 10 мМ, рассчитанных по содержанию Са2+. Об активности фермента судили по концентрации цАМФ, которую определяли методом иммуноферментного анализа. Активность выражали в мг белка/мин. Белок в пробе определяли по методу Бредфорда. Контролем служили образцы без добавления кальция. Эксперименты проводили в двукратной биологической и четырёхкратной аналитической повторностях. Результаты обрабатывали статистически с помощью программы SigmaPlot v. 12.3 (“SYSTAT Software”, США). По литературным данным свободные ионы Са2+ в растительных клетках присутствуют в микромолярных концентрациях. Эти концентрации могут резко и кратковременно повышаться (до миллимолей в течение нескольких секунд) под влиянием стрессоров разной природы (White, Broadley, 2003).

Поэтому в наших экспериментах мы применяли кальций в микро- и миллимолярных концентрациях.

RESULTS

В корнях растений чувствительного сорта в варианте без ЭПС добавление в среду роста растений кальция при всех концентрациях не оказывало влияния на активность тмАЦ, тогда как после добавлении ЭПС кальций при самой высокой концентрации (10 мМ) ингибировал активность фермента на 30% (рис. 1 а , б ). В стеблях тех же растений в варианте без ЭПС 1 мкМ, 500 мкМ и 1 мМ кальция существенно стимулировали активность тмАЦ (рис. 1 а ). После инкубации с ЭПС при высоких концентрациях этого катиона (1 и 10 мМ) наблюдалось значительное ингибирование, особенно в стеблях, активности тмАЦ (рис. 1 б ).

У картофеля, резистентного к Сms сорта, в корнях активность тмАЦ после добавления кальция возросла как в варианте с ЭПС, так и без него. Чем больше была концентрация кальция, тем выше была активность фермента (рис. 2а, б). В варианте с ЭПС активирующий эффект всех концентраций Са2+ был более выраженным. В клетках стеблей тех же растений в варианте без ЭПС активность тмАЦ не изменилась в присутствии всех концентраций кальция, но после добавлении ЭПС значительно возросла, особенно при миллимолярных концентрациях катиона (рис. 2б).

Коицент рати Саг*

в 5

( б )

llllll

■ корень

□ стебель

500 нМ 1 мкМ 500 мкМ 1 мМ 10 мМ

Концентрация Са ²⁺

Figure-1. Изменение активности тмАЦ из клеток растений картофеля восприимчивого сорта под влиянием разных концентраций ионов кальция. Здесь и на рис. 2 (а) – контрольный вариант (без добавления ЭПС Cms), (б) – опытный вариант (с добавлением ЭПС Cms). M ± m.

Figure-2. Изменение активности тмАЦ из клеток растений картофеля устойчивого сорта под влиянием различных концентраций ионов кальция.

DISCUSSION

Модуляция активности тмАЦ ионами кальция вероятно, свидетельствует о наличии нескольких изоформ этого фермента, отличающихся по чувствительности к данному иону. Возможно, у растений обоих сортов спектр изоформ тмАЦ различен. На основании полученных данных можно предположить, что эта особенность является одним из механизмов разной устойчивости растений данных сортов к Cms и обусловлена развитием/блокировкой системного ответа растений картофеля обоих сортов на биотический стрессор. Ранее (Ломоватская и др., 2004) мы также установили зависимость системного ответа на биотический стрессор аденилатциклазной сигнальной системы растений картофеля от их сортовой принадлежности.

Опираясь на ранее полученные результаты (Романенко, Ломоватская, 2017) о наличии в структуре плазмалеммы и мембран клеточных органелл растений картофеля этих сортов цАМФ-зависимых Са2+-каналов, локализация которых количественно изменялась в ответ на воздействие

ЭПС Cms , можно предположить существование возможного механизма взаимовлияния аденилатциклазной и кальциевой сигнальных систем при биотическом стрессе. В цитируемой работе мы показали, что в клетках корней растений тех же сортов картофеля ЭПС Cms интенсивно модулировали активность тмАЦ. По крайней мере, в клеточной стенке и плазмалемме клеток растений картофеля присутствуют рецепторы к ЭПС Cms , имеющие количественные и качественные сортовые различия. У растений восприимчивого сорта эти рецепторы обладали сродством к супрессорным компонентам ЭПС, у растений устойчивого сорта – к элиситорным (Романенко и др , 1998). Очевидно, что системная реакция индуцируется в корнях, непосредственно контактирующих со стрессовым фактором. При этом под воздействием стрессора в плазмалемме клеток корней растений возникает электрохимический потенциал, системно распространяющийся до верхушки стебля (Новикова и др , 2017), а активность тмАЦ меняется под его воздействием (Соореr et al., 1998). Модуляция активности тмАЦ может приводить к локальному изменению концентрации цАМФ, что способствует активации потенциалзависимых Са²⁺-каналов, повышая кратковременно и локально концентрацию ионов кальция в составе плазмалеммы за счёт их выхода из свободного пространства клеточной стенки (Новикова и др , 2017). Дополнительный вклад в супрессию развития системного сигнала в клетках растений чувствительного сорта вносит ингибирование тмАЦ высокими концентрациями кальция. Очевидно, что для растений каждого сорта картофеля существует тонкая внутренняя регуляция этих процессов, зависящая от первичных триггеров сигналов, в частности от рецепторов, а также от активности тмАЦ.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” с использованием коллекций ЦКП “Биоресурсный центр” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).