Частота полиморфизмов генов TNF-a, ИЛ 1b, ИЛ-4, ИЛ-10 при параректальных свищах

Обоснование

В настоящее время при патологии прямой кишки большое значение придается наследственным факторам [1; 2]. Что касается воспалительных заболеваний прямой кишки, то здесь клиническую значимость имеют воспалительные факторы, в частности цитокиновое звено [3–6]. Согласно имеющейся информации, при действии цитокинов на организм, большое значение отводится генетической составляющей. Доказано, что частота полиморфизмов этих генов способна вызывать и поддерживать как острые, так и хронические воспалительные процессы [7–10]. По-видимому, изложенные моменты могут быть причастны к развитию параректальных свищей. Однако, убедительных данных на данный момент в этом направлении пока не существует. Реализация этого направления в данной области хирургии, безусловно, имеет большую клиническую значимость в плане прогнозирования течения заболевания его исходов и степени эффективности существующих методов лечения. Эти данные послужили основой для выполнения данного исследования.

Цель. Изучение взаимосвязи полиморфизма генов про- и противовоспалительных цитокинов: TNFa (G308A), IL1b (T31C), IL4 (C589T), IL10 (G1082A) и IL10 (C592A) с развитием и течением параректальных свищей.

Исследовать клиническое значение полиморфных вариантов генов TNF G308A, IL 1b T31C, IL4 C589T, IL10 G1082A и C592A в крови при параректальных свищах.

Методы

Исследовали полиморфизмы TNF G308A, IL 1b T31C, IL4 C589T, IL10 G1082A и C592A в регуляторных областях генов цитокинов, как потенциальные маркеры предрасположенности к параректальным свищам и острым парапроктитам – воспалительным заболеваниям с неясной генетической природой.

Провели исследование полиморфизма регуляторных областей генов цитокинов: TNF G308A, IL 1b T31C, IL4 C589T, IL10 G1082A и C592A. Отбор указанных генов объясняется тем, что частота этих полиморфизмов может

служить потенциальным маркером предрасположенности к развитию параректальных свищей и острых парапроктитов, представляющих собой воспалительные заболевания с неясным генетическим фоном.

В основную группу вошел 71 пациент в возрасте от 24 до 74 лет, которые проходили амбулаторное лечение по поводу параректальных свищей. Контрольную группу составили 30 добровольцев без патологии со стороны перианальной области (средний возраст 37 лет). Диагноз выставлялся на основании клинических данных, данных инструментального обследования, а также подтверждался при выполнении оперативного вмешательства.

Процедура забора крови была проведена с соблюдением принципа добровольного информированного согласия пациента.

Для исследования использовали образец цельной венозной крови, собранный в пробирку, содержащую 200 мкл антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА).

После этого биоматериал переносили в пробирку для проведения ПЦР в реальном времени. Благодаря циклическим изменениям температуры, обеспечиваемым ампли-фикатором, происходит расхождение цепей ДНК. После достижения целевой температуры, в реакцию добавляли праймеры, обеспечивающие специфическое связывание с целевыми нуклеотидными последовательностями, что позволяло амплифицировать заданный фрагмент генома. С целью активации репликации добавляли фермент ДНК-полимеразу.

Затем добавляли фермент ДНК-полимеразу с целью активации процесса репликации. Данная методика позволяла выявить изменения в исследуемых генах. Таким образом происходило выявление полиморфизмов исследуемого гена. Эксперименты выполнялись с использованием амплификаторов DT prime 5 (96 лунок) и DT lite 5 (48 лунок) производства ООО «ДНК-Технология», в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ данных был выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0 и электронных таблиц Microsoft Excel.

Проверку распределения результатов на соответствие закону нормального распределения проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для проверки статистической значимости различий между группами использовали критерия χ ² Пирсона. При сравнении групп использовали U-критерий Манна-Уитни. Статистически значимый уровень различий регистрировали при р <0,05. В качестве количественной меры эффекта при сравнении относительных величин использовали показатели отношения шансов (ОШ) и этиологическую долю относительного риска.

Структура основной группы: женщины – 41 (57,7%), мужчины – 30 (42,3%). Возраст до 35 лет – 14 (19,7%), 36-50 лет – 38 (53,5%), старше 51 года – 19 (26,8%). Группу контроля составляют женщины – 19 (63,3%) и мужчины – 11 (36,7%). Возрастная градация: до 35 лет – 14 (46,7%), 36–50 – 12 (40%), 51 год и более – 4 (13,3%).

Структура свищей в основной группе – интрасфин-ктерные и межсфинктерные – 21 (29,6%), транссфинктерные – 45 (63,4%), из них высокие транссфинктерные свищи – 2 (4,4%), экстрасфинктерные свищи – 5 (7%). Проведенное оперативное лечение: первично радикальные операции – фистулэктомия: операция Габриэля – 27 (38%), операция типа LIFT – 1 (1,4%), фистулотомия с вапоризацией эпителиальной выстилки – 34 (47,9%), FILAC – 2 (2,8%). Двухэтапные операции с применением лигатурного метода – 6 (8,4%). Процент первично радикальных операций в разных вариантах исполнения составил 91,6%. Процент рецидива составил 7% (экстрасфинктерный свищ – 2, транссфинктерные свищи – 3).

Дизайн исследования

Одноцентровое, проспективное, контролируемое исследование.

В период с 2023 по 2024 гг. в клинико-диагностической лаборатории Ярославского государственного медицинского университета (ЯГМУ) было проведено генетическое исследование 71 амбулаторного пациента с параректальными свищами. В контрольную группу вошли 30 условно здоровых добровольцев (средний возраст 37 лет) без патологии перианальной области.

Критерии соответствия

У всех пациентов, прошедших обследование, диагноз параректального свища был верифицирован на основании комплексной оценки, включающей клинические проявления, анамнестические данные, результаты МРТ и интраоперационное подтверждение.

Условия проведения

Эксперименты были выполнены в лаборатории генетики ЯГМУ.

Продолжительность исследования

В связи с неизменностью генотипа каждого пациента на протяжении жизни, исследование проводилось однократно для каждого больного.

Описание медицинского вмешательства

Хирургическое лечение свищей, включая предоперационную подготовку, анестезию и послеоперационное ведение пациентов, проводилось с учетом вида свища и степени его тяжести.

Основной исход исследования

Основными критериями оценки эффективности лечения являлись полная эпителизация послеоперационной раны и отсутствие болевого синдрома в послеоперационном периоде.

Результаты исследования

В группе эксперимента распространенность мутации гена по гомозиготному варианту составила: 22,5% для ва-

рианта T31C гена IL1b, 5,6% для варианта C589T гена IL4, 36,6% для варианта G1082 гена IL10, 9,9% для варианта C592A гена IL10 и 1,4% для варианта G308A гена TNF α .

Анализ контрольной группы выявил следующие показатели распределения мутаций: IL1b T31C – 3,3%, IL10 G1082 – 31,25%.

Гены TNF α (G308A), IL4 (C589T) и IL10 (C592A) не содержали мутаций в данной группе.

В обеих исследуемых группах наиболее часто встречалась мутация G1082 гена IL10. В экспериментальной группе её доля составила 36,6%, а в контрольной – 30%.

Мутация C592A гена IL10 в экспериментальной группе наблюдалась значительно реже, чем G1082 (всего 9,9%, что в три раза меньше). В контрольной группе эта мутация не была обнаружена.

Частота мутации T31C гена IL1b в экспериментальной группе (22,5%) была существенно выше, чем в контрольной (3,3%), превышая её в 6,8 раза.

Мутация C589T гена IL4 была выявлена исключительно в экспериментальной группе, где её доля составила 5,6%. Распространенность мутации гена IL 1b T31C варьирует в исследуемой группе. Мужчины демонстрируют более высокую частоту мутации (26,7%), чем женщины (19,5%). Распределение полиморфного варианта гена IL1b T31C демонстрирует возрастную зависимость. Максимальная частота (36,8%) наблюдалась в возрастной группе старше 51 года. В группах 36–50 лет и до 35 лет частота полиморфизма составила 18,4% и 14,3% соответственно. Полученные данные свидетельствуют о положительной корреляции между возрастом и частотой встречаемости данного полиморфного варианта.

Исследование показало, что гомозиготная мутация C589T в гене IL4 более распространена среди мужчин среднего возраста (15%) по сравнению с женщинами старше 51 года (7,1%). В средней возрастной группе мутация встречалась у 7,9% обследованных, а в старшей возрастной группе – у 5,3%.

В основной группе исследования мутация G1082 чаще выявлялась у женщин (39%), чем у мужчин (33,3%). Наибольшая доля носителей гомозиготной формы мутации наблюдалась в младшей возрастной группе (57,1%). В средней возрастной группе этот показатель значительно снизился и составил 28,9%. У пациентов старше 51 года частота гомозиготной мутации составляет 36,8%.

Распределение полиморфного варианта C592A гена IL10 демонстрирует обратную зависимость от возраста. Наибольшая частота встречаемости данного аллеля наблюдается в возрастной группе до 35 лет (21,4%), с последующим снижением в средней возрастной группе (5,3%) и полным отсутствием в старшей возрастной группе.

В зависимости от разновидности свищей (Табл. 2), среди пациентов с интрасфинктерными и межсфинктерными свищами (свищами, расположенными низко), гомозиготный вариант G1082 мутации гена IL10 встречался наиболее часто, а именно в 47,6% случаев.

Среди пациентов с более высоким расположением свищей данная мутация встречалась у транссфинктерных в 30,2%, у экстрасфинктерных в 40%. Среди пациентов с низкими свищами мутация гена IL1b T31C выявлена в 9,5% у инстрасфинктерных, 25,6% в группе транссфинктерных свищей. В группе с высокими свищами частота встречаемости данной мутации составила 20%. Мутация гена IL10 по гомозиготному варианту С592А выявлена

Табл. 1. Частота мутаций в генах TNF, IL 1b, IL 4, IL 10 при параректальных свищах

Группа больных			Частота мутаций генов
Параректальный свищ	Всего n = 71		TNF G308A	IL 1b T31C	IL4 C589T	IL10 G1082	IL10 C592A
			1 (1,4%)	16* (22,5%)	4 (5,6%)	26 (36,6%)	7 (9,9%)
	Пол n = 71	Мужчины, n = 30	0	8** (26,7%)	3** (10%)	10** (33,3%)	2 (6,7%)
		Женщины n = 41	1 (2,3%)	8** (19,5%)	1 (2,4%)	16** (39%)	5 (12,2%)
	Возраст n = 71	до 35 лет, n = 14	0	2 (14,3%)	0	8 (57,1%)	3 (21,4%)
		от 36 до 50 лет, n = 38	1(2,6%)	7 (18,4%)	3 (7,9%)	11 (28,9%)	3 (7,9%)
		старше 51 года, n = 19	0	7 (36,8%)	1 (5,3%)	7 (36,8%)	1 (5,3%)
Группа контроля	Всего n = 30		0	1 (3,3%)	0	9 (30%)	0

Табл. 2. Частота мутаций в генах TNF, IL 1b, IL 4, IL 10 при параректальных свищах в зависимости от их вида по отношению к сфинктеру

Классификация свищей по отношению к сфинктеру, n = 71		Частота мутаций генов
		TNF G308A	IL 1b T31C	IL4 C589T	IL10 G1082	IL10 C592A
Интрасфинктерный (межсфинктерный), n = 21		0	2 (9,5%)	2(9,5%)	10(47,6%)	2(9,5%)
Транссфинктерные, n = 45	Низкие (меньше 1/3 внутреннего сфинктера), n = 43	1 (2,3%)	11 (25,6%)*	2 (4,7%)	13 (30,2%)	4 (9,3%)
	Высокие, n = 2	0	0	0	0	0
Экстрасфинктерные, n = 5		0	1 (20%)	0	2 (40%)	1(20%)
Задний свищ, n = 37		1 (2,7%)	8 (21,6%)	2 (5,4%)	13 (35,1%)	4 (10,8%)
Передний свищ, n = 34		0	8 (23,5%)	2 (5,9%)	13 (38,2%)	3 (8,8%)

Примечание : * – достоверность к группе контроля (p<0,05).

Табл. 3. Частота мутаций в генах TNF, IL 1b, IL 4, IL 10 при параректальных свищах в зависимости от наличия парапроктита и рецидива заболевания в анамнезе

Группа больных, n=71	Частота мутаций генов
	TNF G308A	IL 1b T31C	IL4 C589T	IL10 G1082	IL10 C592A
Наличие парапроктита в анамнезе, n = 22	0	7* (31,8%)	3 (13,6%)	10 (45,5%)	4(18,2%)
Первично-сформированный свищ, n = 49	1 (2%)	9 (18,4%)	1 (2%)	16 (32,7%)	3 (6,1%)
Рецидив заболевания, n = 5	0	2 (40%)	0	2 (40%)	1 (20%)
Отсутствие рецидива, n = 66	1 (1,5%)	14 (21,2%)	3 (4,5%)	24 (36,4%)	6 (9%)

Примечание : * – достоверность к группе сравнения (p<0,05).

в 9,5% среди низких свищей, тогда как среди высоких – только в 20%.

Наблюдения указывают на влияние генетической предрасположенности на клиническую картину параректальных свищей, но подчеркивают, что тяжесть заболевания определяется не только наследственностью.

В зависимости от расположения внутреннего свищевого отверстия, частота полиморфизма гена, кодирующего IL1b T31C, оказалась незначительно выше у пациентов с расположением по передней полуокружности (на 12 часах) – 23,5%. Мутация генов IL10 G1082 и IL4 C589T встречаются чаще также в группе передних свищей 38,2% и 5,9% соответственно. Тогда как мутация гена IL10 С592А встречается реже в данной группе – в 8,8%.

Полученные результаты не выявили значимых различий в частоте полиморфных вариантов исследуемых генов между группами пациентов с разными типами свищей, определяемыми по локализации внутреннего свищевого отверстия.

При этом, частота полиморфизма генов встречается чаще в группе с наличием парапроктита в анамнезе. Так, мутация гена IL1b T31C в группе с первично-сформированными свищами составила 18,4%, а в группе с ранее выявленными парапроктитами – 31,8%. Полиморфный вариант гена IL4 C589T при наличии парапроктита составляет 13,6%, при его отсутствии – 2%. Среди пациентов с парапроктитами, мутации гена интерлейкина 10 G1082 и С592А значительно превышают показания группы без ранее выявленных гнойных осложнений, составляют 45,5% и 18,2% к 32,7% и 6,1%, соответственно.

Зависимости от рецидивов заболевания (n = 5), мутации генов TNF G308A и IL4 С589Т не выявлено. Распространенность гомозиготной мутации G1082 гена IL10 была сопоставима в обеих исследуемых группах, составляя 40% в группе рецидива и 36,4% в группе отсутствия рецидива свищей. В отличие от этого, частота встречаемости мутаций T31C гена IL1b и C592A гена IL10 была статистически значимо ниже в группе пациентов, не имевших рецидива (21,2% и 9%, соответственно), по сравнению с группой пациентов с рецидивом (40% и 20%, соответственно).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Представлены данные, расширившие существующие представления о возможности генетического тестиро- вания при прогнозировании течения параректальных свищей. В рамках перспективного планирования целесообразно предусмотреть расширение перечня генетических исследований при данной патологии.

Обсуждение основного результата исследования

Увеличение частоты мутаций в генах IL1b T31C и IL10 С592А может служить прогностическим маркером, указывающим на потенциальный риск развития рецидива свища. Полученные данные позволяют предположить, что эти генетические изменения могут быть использованы в качестве критериев для прогнозирования рецидива при данной патологии.

Ограничения исследования

Исследование имеет этическое ограничение: участие пациентов возможно только при наличии их добровольного согласия. В исследовании участвовала группа пациентов с параректальными свищами. Важным ограничением является необходимость строгого соблюдения методологии лабораторных исследований, поскольку отклонения от нее могут существенно исказить результаты и выводы.

Заключение

Представленные данные свидетельствуют о том, что при увеличении частоты мутации гена IL1b T31C с возрастом вероятность параректальных свищей возрастает. Такая закономерность более вероятна у мужчин и у женщин старше 51 года. Вероятность развития параректальных свищей после перенесенного раннее парапроктита повышается при увеличении частоты мутаций генов IL1b T31C и IL10 G1082A и С592А. После оперативных вмешательств рецидив параректального свища развивается при увеличении частоты мутаций генов IL1b T31C и IL10 С592А до 40% и 20% соответственно. Полученные данные могут послужить основой для внедрения персонализированного подхода к лечению данного контингента больных.