Чувствительность биопленочных форм бактерий Staphylococcus aureus, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом, к действию антисептиков и дезинфицирующих средств

На долю остеомиелита в общей структуре гнойно-воспалительных заболеваний приходится 10 %, при этом частота рецидивов составляет от 10 до 40 % [1, 2]. Бактерии Staphylococcus aureus относятся к числу патогенов, которые чаще всего выделяют из ран при хроническом остеомиелите, где они обычно находятся в составе биоплёнки, характеризующейся высокой гетерогенностью клеток с измененным фенотипом, возникающим вследствие их пониженной пролиферативной и метаболической активности [3, 4]. Известно, что в составе биоплёнки увеличивается вирулентность и патогенность всех возбудителей [5, 6]. Матрикс биоплёнки способен удерживать и инактивировать антибиотики [6, 7]. Одним из способов повышения эффективности антибиотикотерапии является их одновременное использование с препаратами, действующими на структуру биоплёнки (ферменты, фаги, различные дезинфектанты), активность которых может быть направлена на подавление адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией и др. [8–10].

Для предупреждения образования и борьбы с биоплёнками разработаны различные методы, в том числе их физическое удаление и ирригация ран дезинфицирующими растворами [11]. В клинической практике для обработки ран в большинстве случаев традиционно используют дезинфектанты на основе перекиси водорода и спирта. Антимикробные дезинфицирующие средства применяют для обработки поверхностей и медицинского оборудования для предотвращения передачи патогенов пациентам [12–14].

При лечении пациентов с остеомиелитом одним из первых и важных этапов является обработка ран антисептиками и дезинфектантами, однако в литературе имеются разноречивые мнения об их эффективности в отношении биоплёночных форм бактерий [12–15]. Это свидетельствует о необходимости изучения структуры и функционирования биоплёнок ведущих возбудителей хронического остеомиелита, мониторинга их чувствительности к антисептическим препаратам.

Цель работы — оценить бактерицидную активность перекиси водорода и спиртового кожного антисептика в отношении биоплёнок, образованных штаммами S. aureus , выделенными у пациентов с хроническим остеомиелитом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования — клинические изоляты Staphylococcus aureus ( n = 38), в том числе метициллин-резистентные стафилококки ( MRSA , n = 12), выделенные из ран и свищей во время операции у пациентов с хроническим остеомиелитом.

Выделение бактерий проводили стандартными микробиологическими методами. Идентификацию до вида осуществляли на бактериологическом анализаторе BactoScreen, включающим MALDI масс-спектометр и программное обеспечение для управления, анализа и идентификации микроорганизмов BactoScreen-ID. В качестве контроля использован референтный штамм из коллекции типовых культур (ATCC) S. aureus 25923.

Для оценки бактерицидного действия дезинфицирующих средств и кожного антисептика в отношении выделенных клинических штаммов применяли диско-диффузионный метод. Готовили рабочие суспензии суточных культур бактерий S. aureus , выращенных на плотной питательной среде (МПА) при температуре 37 °С путем прямого суспендирования колоний чистой культуры в стерильном изотоническом растворе. Плотность суспензии соответствовала стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. На поверхность газона, полученного из суспензии бактериальной культуры на агаре Мюлера – Хинтона, помещали стерильные диски из картона фильтровального технического (ГОСТ 6722-75), пропитанные 1–3 %, 2–6 % растворами H 2 O 2 и кожным антисептиком (КА). Чашки инкубировали при температуре (35 ± 1) °С в течение 24 часов. Для оценки эффективности каждого дезинфицирующего средства измеряли диаметр зоны ингибирования микроорганизмов вокруг дисков. Каждый тест повторяли три раза, результаты усредняли.

Биоплёнки бактерий S. aureus выращивали в 96-луночных планшетах и на покровных стеклах в течение 24 часов. Суточные биопленки обрабатывали дезинфицирующими средствами согласно ранее разработанной схеме [9] и помещали в термостат на 24 часа (48 часов эксперимента).

Эксперимент был разделен на четыре серии:

• —    1 серия — определение биопленкообразующей способности (БО) клинических изолятов S. aureus без воздействия антисептика (контрольная группа);

• —    2 серия — БО после воздействия 3 % H 2 O 2 ;

• —    3 серия — БО после воздействия 6 % H 2 O 2 ;

• —    4 серия — БО после воздействия кожным спиртовым антисептиком (60 % 2-пропонол, 10 % 1-пропанол).

Для контроля качества исследования был использован стерильный мясо-пептонный бульон (МПБ).

Действие антисептиков и дезинфицирующих средств на моновидовые биоплёнки S. aureus оценивали визуально на покровных стеклах с помощью микроскопа Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Германия), а также количественно на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Все эксперименты проведены в четырех повторах. Активность биопленкообразования характеризовали как высокую (OD 630 > 0,360), среднюю (0,180 < OD 630 ≤ 0,360), слабую (0,090 < OD 630 ≤ 0,180) и отсутствующую (OD 630 < 0,090).

Используя модульное программное обеспечение ZEN (Carl Zeiss, Германия) и программу ImageJ (США), оцифровывали поля зрения со сформированной биопленкой на поверхности покровного стекла, измеряли площадь поля зрения, количество и площадь, занимаемую одиночными адгезированными клетками (ОАК) и микроколониями (МК).

Для обработки и статистического анализа полученных результатов использовали программу Gnumeric 1.12.17. Цифровые данные представлены в виде медианы (Ме) и квартилей (Q25–Q75). Непараметрический критерий Вилкоксона применяли для определения различий между группами. Различия считали значимыми при р < 0,05.

Исследование выполнено в НМИЦ ТО им. акад. Г.А. Илизарова на базе лаборатории микробиологии и отдела доклинических и лабораторных исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Диски, пропитанные 3 % H 2 O 2 , 6 % H 2 O 2 и кожным антисептиком, оказывали бактерицидное действие в отношении всех исследуемых клинических изолятов S. aureus . Значительная зона задержки роста отмечена для перекиси водорода (рис. 1). Диаметр зоны задержки роста бактерий S. aureus в зависимости от дезинфицирующего средства составлял (45 ± 3) мм в случае 3 % H 2 O 2 ; (47 ± 2) мм — 6 % H 2 O 2 ; (35 ± 3) мм — КА.

Активность формирования биоплёнки метициллин-чувствительными изолятами S. aureus ( MSSA ) контрольной серии составляла 0,351 (0,311; 0,359) ед.опт.пл., метициллин-резистент-ными — 0,275 (0,258; 0,290) ( p = 0,044) ед.опт.пл., что соответствовало среднему уровню пленкообразования. При добавлении 3 % и 6 % перекиси водорода интенсивность биоплёнкообразования MSSA снижалась в 1,2 раза по сравнению с контрольными значениями ( p = 0,04 и p = 0,04), MRSA — в 1,5 раза ( p = 0,033 и p = 0,027). В четвертой серии эксперимента добавление кожного антисептика к сформированным суточным биоплёнкам не приводило к значимому снижению уровня биоплёнкообразования (рис. 2).

Рис. 1. Бактерицидное действие 1 — 3 % H 2 O 2 , 2 — 6 % H 2 O 2 и 3 — кожного антисептика на клинические штаммы S. aureus

Все клинические изоляты с различной степенью интенсивности формировали биоплёнку на поверхности покровного стекла. Обработка суточной биоплёнки, образованной штаммами S. aureus , 3 % и 6 % перекисью водорода приводила к значимому изменению доли МК на единицу площади поля зрения по сравнению с контролем и КА. Кожный спиртовый антисептик был менее эффективен в отношении МК (рис. 3).

Рис. 2. Биоплёнкообразование MSSA и MRSA в зависимости от используемого дезинфицирующего средства через 48 ч.

Рис. 3. Площадь, занимаемая МК S. aureus и MRSA на поверхности покровного стекла через 48 ч.

Биоплёнки в группах отличались по структуре и морфологии. В контрольной группе после воздействия на биоплёнку 3 % H2O2 и КА большую часть поверхности покровного стекла занимали МК размером более 1000 мкм2, после обработки 6 % H2O2 их доля была в два–шесть раз меньше. В контрольной группе биоплёнка на поверхности покровного стекла была представлена крупными и расположенными между ними более мелкими МК, а также большим количеством ОАК. После обработки 3 % H2O2 биоплёнка приобретала вид сети с глыбчатыми облакообразными крупными МК с изменённым цветом красителя. После обработки 6 % H2O2 на поверхности покровного стекла преобладали МК размером менее 1000 мкм2. КА также как и перекись водорода изменял цвет красителя, биоплёнка была представлена крупными грубыми глыбчатыми структурами (рис. 4).

Рис. 4. Изображения полей зрения биоплёнки, образованной клиническими штаммами S. aureus и MRSA на поверхности покровного стекла: a — S. aureus ; b — S. aureus + 3 % H 2 O 2 ; c — S. aureus + 6 % H 2 O 2 ; d — S. aureus + КА; e — MRSA ; f — MRSA + 3 % H 2 O 2 ; g — MRSA + 6 % H 2 O 2 ; h — MRSA + КА. Световая микроскопия. Увеличение ×400. Окраска карболовым раствором генцианвиолета

Количество ОАК зависело от концентрации и вида антисептика. Обработка 6 % перекисью водорода и КА значительно снижали количество ОАК на поверхности покровного стекла по сравнению с контролем ( p = 0,045; p = 0,0014) (рис. 5).

Биоплёнкообразование на поверхности покровного стекла резистентными штаммами существенно отличалось. Средние показатели площади и количества МК MRSA в контрольной группе не имели значимых различий с соответствующими по-

Рис. 5. Количество ОАК S. aureus и MRSA на поверхности покровного стекла через 48 ч.

казателями чувствительного стафилококка, при этом наблюдали отличия в структуре биоплёнки. В биоплёнках, образованных

MRSA, преобладали МК размером от 10 до 10000 мкм2, у чувствительного стафилококка доля таких МК была в два раза меньше. Воздействие на биоплёнку MRSA 3 % H2O2 приводило к незначительному увеличению количества и доли в площади поля зрения МК и ОАК по сравнению с контрольной группой и значимым различиям с MSSA (p = 0,0000003 и p = 0,000000004) (рис. 3).

Обработка 6 % H 2 O 2 биоплёнки MRSA приводила к уменьшению площади, занимаемой МК на поверхности покровного стекла, по сравнению с контрольной группой ( р = 0,042) и было значимо выше по сравнению с MSSA . В структуре биоплёнки преобладали МК размером до 100 мкм², их доля была в два раза больше, чем в биоплёнке MSSA .

Также как и в случае с чувствительным стафилококком КА был неэффективен в отношении МК MRSA (рис. 3).

Морфология биоплёнок MRSA отличалась от биоплёнок MSSA . В контрольной группе и после обработки перекисью водорода они были более однородными и плоскими, отдельные поля зрения были полностью заполнены объединенными в сеть МК. После обработки КА до 40 % поверхности покровного стекла занимали крупные МК размером более 10 000 мкм² (рис. 4).

В контрольной серии количество ОАК MRSA было выше в 2,3 раза по сравнению с MSSA . После воздействия 6 % H 2 O 2 и КА наблюдали значимое снижение ОАК в 1,7 и 3,4 раза по сравнению с контролем. Количество ОАК MRSA и MSSA после обработки КА не отличалось (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Биоплёнка — это один из способов адаптации микроорганизмов к физическим и химическим воздействиям окружающей среды [5, 6, 16]. Известно, что в состоянии биоплёнки бактерии обладает толерантностью к дезинфицирующим веществам и антисептикам [8, 10]. В клинической практике для очистки и лечения хронических ран часто применяют различные биоциды, в том числе перекись водорода. Исследований влияния H 2 O 2 на заживление хронических ран немного. Известно, что перекись водорода может вызывать естественные клеточные воспалительные реакции и стимулировать заживление ран, при этом ее действие зависит от дозы [17]. Низкие концентрации H 2 O 2 разрушают клеточные мембраны, окисляют ДНК, дестабилизируют ферменты и белки, быстро окисляясь до гидроксильного радикала (OH), что способствует окислительному стрессу [14]. Воздействие сублетальных концентраций H 2 O 2 на S. aureus может привести к появлению клеток с фенотипом вариантов малых колоний (SCV) за счёт повышенной частоты мутаций и последующей репликации, что будет способствовать выживанию возбудителя в тканях организма [18]. В ряде работ показана сниженная восприимчивость биоплёнок к H 2 O 2 по сравнению с планктонными клетками бактерий [19]. Согласно данным другого исследования, H 2 O 2 может удалять как матрикс биопленок S. аureus , так и жизнеспособную бактериальную массу [20]. Бактериальные клетки в поверхностном слое биоплёнки вырабатывают множество ферментов, — каталазу, пероксидазу, глутатионредуктазу и супероксиддисмутазу, которые могут расщеплять H 2 O 2 . Показано, что H 2 O 2 не может эффективно проникать в зрелые биоплёнки, так как в поверхностном слое происходит её разрушение, препятствующее эффективной диффузии дезинфектанта во внутренние слои [21]. Распространённым ферментом, вырабатываемым бактериями, является каталаза. Разложение H 2 O 2 из-за продукции каталазы может быть причиной необходимости высоких концентраций и более длительного времени контакта с поверхностью H 2 O 2 в качестве антибиоплёночного агента [16].

Мы сравнили действие дезинфицирующих растворов (3 % и 6 % H 2 O 2 , спиртового КА) в отношении моновидовых биоплёнок, образованных клиническими штаммами MSSA и MRSA . Наши результаты показывают, что различная активность в отношении моновидовых биоплёнок дезинфицирующих веществ зависит от их вида и концентрации. Перекись водорода и спиртовый антисептик не обладали бактерицидными свойствами в отношении биоплёнок, но подавляли их образование. Так, после обработки биоплёнок, образованных штаммами S. aureus , 3 % и 6 % перекисью водорода существенно снижалась активность плёнкообразования, что подтверждают результаты исследования на полистироловых планшетах, и значимо уменьшалась площадь, занимаемая МК на поверхности покровного стекла, по сравнению с контрольной группой. Аналогичные результаты получили при воздействии на биоплёнки MRSA 6 % перекисью водорода.

После воздействия на биоплёнку MRSA 3 % перекисью водорода происходит увеличение площади, занимаемой МК, применение 3 % H 2 O 2 при орошении ран способствует окислению белков, нуклеиновых кислот и липидов здоровых клеток, что может замедлять заживление ран [17]. Известно, что окислительный стресс может индуцировать образование биоплёнки, толерантной к антибиотикам, и это предполагает, что антисептики могут снижать эффективность препаратов при лечении, что в свою очередь требует увеличения концентрации раствора для усиления антибактериального эффекта [22].

Наши результаты согласуются с данными, полученными в исследованиях in vitro , согласно которым перекись водорода уменьшает объём биоплёнки S. aureus , не оказывая бактерицидного действия [22, 23].

Воздействие 6 % перекисью водорода существенно снижает количество ОАК исследуемых клинических штаммов. После обработки 3 % перекисью водорода, напротив, наблюдается увеличение количества ОАК MRSA .

Согласно данным литературы, биоплёнка S. aureus обладает более высокой толерантностью к антисептикам по сравнению с планктонными бактериями [15, 24, 25].

Кожный спиртовый антисептик был неэффективен в отношении МК биоплёнок. Воздействие спиртового антисептика на МК MRSA приводило к увеличению занимаемой ими площади на поверхности покровного стекла. Более выраженное воздействие КА отмечено в отношении ОАК штаммов S. aureus и MRSA .

Известно, что спирты обладают широким противомикробным спектром действия против бактерий, грибов и вирусов. Механизм их действия неизвестен, предполагают, что он связан с денатурацией мембранных и ферментативных белков. В спиртовых антисептиках в качестве составляющих обычно используют этанол и изопропанол (2-пропанол) [26, 27]. Эффективность антисептиков, содержащих спирт, зависит от его концентрации. Рекомендуемая концентрация спирта обычно составляет 60–95 %. В данном диапазоне спирт взаимодействует с функциональными белками и инактивирует их. При этом спирт с концентрацией 60–75 % денатурирует белки, а более высокие концентрации (> 95 %) вызывают коагуляцию мембранных белков, что предотвращает попадание спирта в клетку [28]. Дока- зано, что спирты с низкой концентрацией, которые используют в качестве дезинфицирующих средств, способствуют образованию биопленок некоторыми бактериями (S. epidermidis) и повышают их устойчивость к дезинфекции [29].

Согласно полученным данным, биоплёнки, образованные клиническими штаммами S. aureus и MRSA обладают более высокой толерантностью к перекиси водорода и антисептику по сравнению с одиночными адгезированными клетками, что может быть связано с отсутствием вокруг них полноценного матрикса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Перекись водорода в концентрации 3 % и 6 % подавляет активность образования биоплёнки клиническими штаммами S. aureus и MRSA , но не удаляет ее полностью с абиотической поверхности, что свидетельствует о бактериостатическом характере действия дезинфицирующего средства. Кожный антисептик неэффективен в отношении биоплёночной формы бактерий, но, вероятно, может оказывать бактерицидное действие на одиночные адгезированные клетки, вокруг которых еще не сформировался экзополисахаридный матрикс.