Циркулирующие актин-связывающие белки при прогрессировании рака гортани и гортаноглотки

Плоскоклеточный рак гортани и гортаноглотки (РГ), как правило, выявляется на поздних стадиях и характеризуется частым рецидивированием и высокой смертностью [1]. Развитие опухолевой прогрессии связано с приобретением клетками мобильности, которая зависит от ремоделирования цитоскелета и обеспечивается рядом молекулярных каскадов, в которых участвуют различные белки, в том числе и актин-связывающие (АСБ) [2, 3]. Актин-связывающие белки, кроме обеспечения локомоции, ассоциированы с другими клеточными процессами: пролиферацией, апоптозом, эндо- и экзоцитозом. Важное значение в развитии злокачественных опухолей принадлежит актин-связывающим белкам: кофилину, профилину, эзрину, фасцину и аденилил-циклаза ассоциированному протеину 1 (САР1) [3–9]. Основная функция САР1 у эукариот – регуляция реконструкции актина в ответ на клеточные сигналы. Показано, что САР1 функционально связан с кофилином 1 и профилином 1 – белками, осуществляющими разборку актиновых филаментов [10–13]. Другими актин-связывающими белками, важными для реогранизации цитоскелета, являются эзрин и фасцин. Эзрин выступает в качестве линкера между плазматической мембраной и актиновым цитоскелетом, участвует в самых разнообразных клеточных процессах, таких как клеточная адгезия, выживание, подвижность, а также сигнальная трансдукция [8]. Фасцин вовлечен в формирование пучков фибриллярного актина и участвует в образовании стабильных долгоживущих протрузий, которые способствуют нарушению эпителиальных межклеточных контактов и приводят к инвазии опухолевых клеток во внеклеточный матрикс [6]. Таким образом, клеточные функции описанных белков разнообразны и поэтому интересны в плане их комплексного изучения при опухолевой прогрессии РГ. До настоящего времени уровень АСБ в кровеносном русле изучен недостаточно, а относительно эзрина и профилина 1 не известно, относятся ли эти белки к циркулирующим маркерам. Не исследовано также, связаны ли циркулирующие АСБ с течением РГ.

Целью исследования явилось изучение циркулирующих АСБ у больных РГ при прогрессировании заболевания.

Материал и методы

Материалом для исследования явилась сыворотка крови 42 больных, поступивших на лечение в 2016–19 гг. в НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН. В группу контроля вошли практически здоровые волонтеры без клинически выявленных опухолевых процессов и хронических заболеваний в стадии обострения. Работа проведена в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003. Все больные, вошедшие в исследование, в обязательном порядке подписывали информированное согласие на участие в протоколе, после чего получено разрешение этического комитета института.

Материал для исследований получали в соответствии со стандартным протоколом и хранили при -80 °С. При выполнении стандартной видеоларингоскопии проводился забор материала для комплексного морфологического исследования с целью верификации диагноза. Во всех случаях опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточной карциномы разной степени дифференцировки. Все пациенты с РГ до настоящего исследования не получали никакого специального лечения.

Анализ сыворотки крови проводили на микро-планшетном ИФА ридере Multiskan FC 100 (ThermoFisher Scientific) с помощью ИФА наборов (табл. 1).

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 8.0. Для проверки распределения на нормальность использовали критерий Колмогорова – Смирнова и критерий Шапиро – Уилкса. Для проверки значимости различий в группах использовали непараметрические критерии: тест Крускала –

Наборы для иммуноферментного анализа immuno-enzyme assay kits			таблица 1/table 1
Набор для ИФА/ Immuno-enzyme assay kits	Белок/ Protein	Производитель/ Manufacturer	Чувствительность/ Sensitivity
Human Adenylyl cyclase-associated protein 1(CAP1) ELISA kit	САР1	Cusabio	0,025–1,6 ng/mL
ELISA Kit for Fascin (FSCN1)	Фасцин 1/ Fascin 1	Cloud-Clone Corp.	0,312–20 ng/mL
ELISA Kit for Profilin 1 (PFN1)	Профилин 1/ Profilin 1	Cloud-Clone Corp.	78–5000 pg/mL
ELISA Kit for Cytovillin (CVL; Ezrin)	Эзрин/ Ezrin	Cloud-Clone Corp.	0,312–20 ng/mL
ELISA Kit for Cofilin 1 (CFL1)	Кофилин 1/ Cofilin 1	Cloud-Clone Corp.	0,312–20 ng/mL
таблица 2/table 2 Содержание актин-связывающих белков в сыворотке крови в зависимости от тяжести патологического процесса the content of actin-binding proteins in blood serum depending on the state of the pathological process
Контроль/Control Ng/ml                 (n=15)	Рак/Cancer (n=41)	p U-test	p Median Test
CFL1               0,84 (0,77;0,93)	0,80 (0,63;1,14)	0,41	0,053
FSCN1              5,46 (3,65;6,9)	1,8 (0,43;8,1)	0,07	0,08
CAP1            0,025 (0,02;0,028)	0,11 (0,08;1,15)	0,001	0,000
EZR                 2,3 (1,9;2,5)	2,1 (1,69;2,56)	0,89	0,1
PFN1 0,26 (0,22;0,29)	0,28 (0,23;0,38)	0,06	0,08

Уоллиса и тест Манна – Уитни. Результаты, приведенные в таблицах, представлены как медиана (Me) с интерквартильным размахом (Q;Q3). Корреляционный анализ проведен с использованием непараметрического критерия Спирмена. Критический уровень значимости для принятия гипотезы о статистически значимом различии был принят равным 0,05.

Результаты

Сравнительный анализ содержания циркулирующих АСБ в системном кровотоке показал, что уровень САР1 значимо был выше в представленной группе больных РГ, чем в группе здоровых волонтеров. При оценке зависимости уровней циркулирующих АСБ от размера опухолевого узла было выявлено, что при увеличении критерия Т значимо увеличивается содержание FSCN1, САР1 и PFN1, причем изменение профилина 1 носило нелинейный характер (табл. 2).

При местнораспространенном опухолевом процессе (T3N0–1M0 и T4N0–1M0 стадии) уровень таких АСБ, как FSCN1и САР1, был значимо выше, при РГ начальной стадии (T1N0M0). Уровень PFN1 в системном кровотоке значимо был выше при запущенных новообразованиях гортани и горта-ноглотки (T4N0–1M0) по сравнению с больными с ранним РГ – T1N0M0 стадии (табл. 3).

На данной выборке больных РГ продемонстрировано, что в метастазировании опухолей этой локализации в основном участвуют 2 циркулирующих АСБ – FSCN1 и САР1. Так, в группе больных РГ, у которых клинически зарегистрированы регионарные метастазы, уровень FSCN1 был достоверно выше в 10 раз, уровень САР1 – на 40 % (табл. 4).

В табл. 5 представлены результаты анализа связи между содержанием актин-связывающих белков в сыворотке крови больных РГ с разным метастатическим статусом методом ранговой корреляции Спирмена. Корреляционный анализ результатов показал, что в сыворотке крови у 27 больных РГ без лимфогенных метастазов (T2–4N0M0) уровень FSCN1 отрицательно коррелировал с уровнем САР1, и положительно был связан с уровнем EZR. У 19 больных РГ (T2–4N1–2M0) в сыворотке крови возникала сильная положительная корреляция между уровнем CAP1 и CFN1.

Обсуждение

Формирование инвазивного и метастатического потенциала трансформированной клетки тесно связано с ремоделированием цитоскелета [7, 14]. Показано, что высокая экспрессия CAP1 связана с лимфогенным метастазированием и выживаемостью больных злокачественными опухолями некоторых локализаций [4, 5, 15]. Чрезмерная экспрессия кофилина 1 обнаружена при раке пищевода, мочевого пузыря и молочной железы [9, 12, 16]. Изменения в экспрессии профилина 1

таблица 3/table 3

Содержание актин-связывающих белков в сыворотке крови в зависимости от стадии опухолевого процесса the content of actin-binding proteins in the blood serum depending on the tumor stage

Ng/ml	T1N0M0 (n=9)	T2N0–1M0 (n=10)	T3N0–1M0 (n=18)	T4N0–1M0 (n=9)
CFL1	0,78 (0,69;1,2)	0,83 (0,6;1,1) р=0,74	0,85 (0,57;0,99) р=0,76	0,76 (0,72;1,3) р=0,81
FSCN1	0,47 (0,46;1,2)	3,18 (0,8;7,8) р=0,11	6,5 (0,3;8,9) р=0,05	5,4 (0,52;7,38) р=0,08
CAP1	0,09 (0,8;1,1)	0,09 (0,7;0,14) р=0,82	0,13 (0,08;0,20) р=0,05	0,15 (0,09;0,2) р=0,01
EZR	2,1 (1,8;2,3)	1,9 (1,47;2,6) р=0,11	2,2 (1,67;2,6) р=0,14	2,5 (1,9;2,67) р=0,13
PFN1	0,24 (0,2;0,35)	0,35 (0,26;0,43) р=0,54	0,28 (0,24;0,34) р=0,08	0,4 (0,22;0,42) р=0,01

Примечание: р – значимость различий с группой T1N0M0.

Note: р – significance of differences with the T1N0M0 group.

таблица 4/table 4

Содержание актин-связывающих белков в сыворотке крови в зависимости от наличия лимфогенных метастазов the content of actin-binding proteins in the blood serum depending on the lymphogenous metastasis

Ng/ml T2–4N0M0 (n=27) T2–4N1–2M0 (n=19) Р, U-test CFL1 0,83 (0,60;1,03) 0,9 (0,65;1,28) 0,42 FSCN1 0,64 (0,34;7,43) 6,73 (6,14;8,3) 0,05 CAP1 0,09 (0,07;0,14) 0,14 (0,07;0,20) 0,05 EZR 2,12 (1,54;2,60) 2,2 (1,89;2,50) 0,83 PFN1 0,34 (0,28;0,41) 0,26 (0,23;0,33) 0,06 таблица 5/table 5

Содержание актин-связывающих белков в сыворотке крови в зависимости от наличия лимфогенных метастазов: коэффициенты корреляции Спирмена (r) (в группах без лимфогенных метастазов и с метастазами)

the content of actin-binding proteins in the blood serum depending on the presence of lymphogenous metastases: spearman’s correlation coefficients (in groups without lymphogenous metastases and with metastases)

АСБ	CFL1	FSCN1	CAP1	EZR	PFN1
CFL1	1	0,2	-0,1	-0,2	0,2
FSCN1	-0,7	1	-0,5	0,6	-0,5
CAP1	0,8	-0,1	1	-0,1	0,1
EZR	0,0	0,4	0,0	1	-0,2
PFN1	0,5	-0,2	0,3	-0,1	1

Примечание: жирным шрифтом выделены корреляционные связи с достоверностью р≤0,05; ячейки, помеченные серым цветом, – группа больных РГ с регионарными метастазами; ячейки, помеченные белым цветом, – группа больных РГ без признаков метастазов.

Note: correlations with significance p≤0.05 are highlighted in bold; cells marked in gray – a group of RH patients with regional metastases; cells marked in white – a group of RH patients without signs of metastases.

Современные знания о содержании актин-связывающих белков в сыворотке крови крайне скудны. Методом протеомного анализа ранее нами было показано, что в сыворотке крови больных плоскоклеточным раком головы и шеи повышено содержание САР1 [5]. Показано увеличение содержания фасцина в сыворотке крови при раке легкого по сравнению со здоровыми донорами [18]. Отмечено увеличение содержания кофилина 1 в сыворотке крови больных раком поджелудочной железы [19].

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие метастатического рака гортани и гор-таноглотки связано с повышением уровня фасцина и САР1, эти показатели можно рассматривать в качестве кандидатных маркеров прогноза метастазирования рака данной локализации.