Цитоархитектоника вентральных ядер таламуса головного мозга детей при хронической внутриутробной гипоксии

ном периоде, которые в дальнейшем приводят к дезадапатции и инвалидизации детей (детский церебральный паралич). Установлено, что влияние характера эмбриогенеза на последующее развитие головного мозга неизмеримо больше его временной доли во всем онтогенетическом развитии. Интерес к эмбриональному периоду связан со стремлением выяснить принцип организации и взаимосвязи формирующихся нервных и глиальных клеток, их контактов, поскольку от этого в дальнейшем зависят сложнейшие функции головного мозга [4, 8, 12].

По данным прозекторского отделения Областной детской клинической больницы Омска доля мертворождений от всего числа вскрытий составляет 44—46 %. Из них 80—87 % приходится на случаи антенатальной гибели плодов. В 91 % случаев в качестве причины, приведшей к гибели плода, рассматривалась абсолютная плацентарная недостаточность, в 9 % – острая плацентарная недостаточность. Алкогольная фетопатия встречалась 1 раз в год.

В работах последних десятилетий все чаще употребляется принцип иерархической регуляции деятельности различных структур головного мозга. Исходя из этого, все менее значимыми становятся такие понятия, как высший и низший, старый и новый. Стало известно, что такие крупные структуры, как лимбическая доля и таламус, состоят из повторяющихся локальных нервных цепей, которые образуют модули. Каждый модуль способен обрабатывать, трансформировать и передавать информацию. Под первичным структурным модулем подкорковой структуры понимают структурную единицу, которая включает в себя минимальную организацию нейронов (группу, цепочку) с их отростками и связями, глией и сосудами и отделенную от другой такой же единицы стенками, состоящими из поля глиальных клеток и/или пучков глиальных клеток [1, 2, 13].

Более крупные структуры, в которые объединяются модули, – области коры или ядра подкорковых структур. Модульным структурам коры у детей различных возрастов, по нашему мнению, уделено достаточно много внимания, однако подкорковые образования, такие как ядра таламуса, требуют более тщательного изучения. При этом необходимо учитывать, что структуры таламуса являются главным коллектором входящих проекций в кору. Огромное количество ядер таламуса подчеркивает необычайную сложность взаимоотношений с корой. Группа модулей, составляющих структуру, сама может быть разбита на подгруппы разными связями и обособленными таким же образом подгруппами в других крупных структурах. Тесно и многократно взаимосвязанные подгруппы модулей в разных и часто далеко отстоящих друг от друга структурах образуют таким обра- зом точно связанные, но распределенные системы («гнездные» распределенные системы). Один модуль может быть членом нескольких таких систем [13, 14].

В связи с описанными выше особенностями строения модульных структур изучаемые нами структуры мы определили как клеточные группировки.

Цель исследования: выявить структурные основы формирования цитоархитектоники вентрального таламуса плодов, новорожденных и младенцев, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии.

Материал и методы. Материалом исследования послужил головной мозг 30 детей обоего пола, погибших анте-, интра- и постнатально в течение первых 2 месяцев жизни от причин, не связанных с патологией головного мозга. Все исследования проведены в соответствии с требованиями этического комитета (протокол № 30 от 15.03.2010).

I группу составили дети 28—37 недель, умершие анте- и интранатально; во II группу вошли дети, погибшие анте- и интранатально в сроках внутриутробного развития 38—42 недели; III группа включала в себя детей со сроком внутриутробного развития 28—37 недель, умерших в течение первых суток жизни; IV группу составили дети со сроком внутриутробного развития 38—42 недели; V группа – дети, умершие в сроках 2—7 дней жизни, со сроком гестации 38—42 недели; в VI группу входили дети со сроком жизни от 8 дней до 2 месяцев. Основным заболеванием у детей первых пяти групп явилась асфиксия плода и новорожденного. Критерием отбора служили отсутствие воспалительных заболеваний и пороков развития головного мозга.

Оценка патогистологической картины показала, что у детей всех детей исследуемых нами групп определялись явные признаки незрелости головного мозга: широкий камбильный слой и псевдожелезистые структуры, субэпендимальные очаги некроза. Все дети на протяжении внутриутробного развития испытывали хроническую внутриутробную гипоксию вследствие хронической внутриутробной недостаточности, подтвержденной морфологически.

Гистологическому анализу были представлены образцы вентробазального комплекса таламуса, который включает в себя заднелатеральное вентральное ядро и заднемедиальное вентральное ядро (сенсорные специфические ядра, группа медиальных ядер) и вентролатеральное ядро (несенсорные специфические ядра, группа медиальных ядер).

Основными методами наших исследований явились: краниотомия, фиксация мозга, нейро-гистологический метод (окраска гематоксилином и эозином, окраска по Нисслю), иммуноги- стохимический метод, микрофотографирование, цитометрия с помощью встроенных инструментов «Photoshop CS», вариационностатистический метод. Классификация нервных клеток коры больших полушарий и таламуса и определение степени их зрелости проводились способом Ю. М. Жаботинского в модификации В. В. Семченко, который позволяет по состоянию вещества Ниссля наиболее полно оценить структурно-функциональные изменения нейронов [5, 9, 10, 11].

В процессе светооптического морфометрического исследования ядер таламуса подсчитывали общую численную плотность нейронов на единицу площади среза, количество нормохромных, гиперхромных несморщенных, гипер-хромных сморщенных, гипохромных нейронов и клеток-теней, которое выражали в виде относительных единиц (% от общего количества) [7]. Для каждого типа клеток учитывали количество свободных нейронов и нейронов, имеющих сателлитную глию. Рассчитывали нейроглиальный индекс как отношение общего числа глиоцитов к числу нейронов на единицу площади. Среди глиальных клеток различали свободные и сателлитные глиоциты. Все количественные показатели пересчитывали на 1 мм2 площади среза. На цифровых изображениях исследуемых ядер таламуса с помощью программы «Photoshop CS 10» при увеличении ×400 измеряли площадь тел и ядер нейронов. При этом учитывали только те нейроны, в которых хорошо дифференцировалось ядро. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) для нейронов рассчитывали как частное от деления площади ядра на площадь цитоплазмы.

Иммуногистохимический метод – высокотехнологичное методическое дополнение к традиционным гистологическим методам исследования в клинической диагностике, который основан на идентификации и определении в клетке и тканях различных структур, имеющих антигенные свойства (реакция «антиген – антитело»).

Для изготовления препаратов использовали непрямой пероксидазный метод, который является трехэтапным и включает в себя систему визуализации, обеспечивая тем самым высокую чувствительность и специфичность иммуногистохимического исследования (позволяет выявить антигены со слабой экспрессией), а также не требует специального оборудования. Универсальность систем визуализации позволяет использовать их в иммунофенотипи-ровании клеток крови и тканей, оценить их функциональное состояние и диагностировать патологические изменения, в том числе онкологические и инфекционные поражения клеток.

Препараты готовили соответственно инструкциям фирмы изготовителя. Толщина парафиновых срезов составляла 2—3 мкм.

Полученные в работе количественные данные обработаны с помощью общепринятых в медико-биологических исследованиях методов системного анализа с использованием программ «Мicrosoft Excel» и «Statistica 6.0» согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных. Для проверки статистических гипотез использовали методы непараметрической статистики (ранговый дисперсионный анализ ANOVA Краскела– Уоллиса, двухвыборочный критерий Колмогорова–Смирнова, критерий Манна–Уитни, корреляционный анализ по методу Спирмена, точный двусторонний критерий Фишера). Материал представлен как медиана ± среднее квартильное отклонение ( Me ± Q ) (непараметрический анализ). Q =½ [( Q 1 –Me ) + ( Me–Q 2 )], где Q 1 – верхний квартиль, Q 2 – нижний квартиль. Показатели, характеризующие ультраструктуру коры и таламуса, представлены в виде 95 % доверительного интервала, для сравнения между группами использовался z-критерий.

Результаты и обсуждение. Морфологическая характеристика клеточных группировок вентрального таламуса у плодов, умерших анте- и интранатально, и у новорожденных, умерших в первые сутки жизни, со сроком гестации 28—37 недель, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии. При изучении строения таламуса мы выявили, что клеточные группировки таламуса в I группе детей, умерших анте- и интранатально при сроке внутриутробного развития 28—37 недель, были представлены 3—8 нормохромными, ги-перхромными несморщенными и гиперхромны-ми сморщенными нейронами в сопровождении глии и 1—2 сосудов. Форма клеточных группировок была округлой. Нейроны также имели овальную или округлую форму. Некоторые поля зрения не содержали клеточных группировок и были представлены диффузно расположенными нервными клетками.

Доля нормохромных нейронов составляла 17,3 % (Me=40,2±30,1/мм²), гиперхромных несморщенных – 26 % (Me=60,3±40,2/мм²) от нейрональной популяции, гиперхромные сморщенных нейроны, клетки-тени и гипохромные нейроны были единичными. Количество сателлитных глиоцитов составляло 85,6 % (Me=482,8±115,6/мм²) от суммарной численности глии. На 1 нейрон приходилось 2 глиоцита на единицу площади среза (НГИ Me=2,4±0,8).

Корреляционный анализ зависимости между нейронами и глиальными клетками в I группе выявил умеренную положительную корреляционную связь между общей численностью нейронов и свободно расположенными глиоцитами

( r= 0,57, p <0,05); общей численностью нейронов и нейронами, окруженными глией ( r= 0,54, p <0,05); общей численной плотностью нейронов и суммарной глией ( r= 0,6, p <0,05); гипер-хромными сморщенными нейронами и общим количеством глиальных клеток ( r= 0,6, p <0,05). В III группе детей, умерших анте- и интранатально со сроком внутриутробного развития 38—42 недели, клеточные группировки формировали подковообразную, округлую и неопределенную формы, были построены из 3—8 нейронов. В поле зрения насчитывалось до 8 клеточных группировок. В то же время в 1 случае встречалось и диффузное расположение нервных клеток без формирования клеточных группировок. Доля нормохромных клеток была 9 % (Me=331,9±35,2/мм²). Гиперхромные несморщенные нейроны составляли 43 % (Me=482,8±115,6/мм²), гиперхромные сморщенные нейроны, клетки-тени, а также гипохромные нейроны были зарегистрированы в единичных случаях. В III группе умеренная отрицательная корреляционная связь выявлялась между нормохромными нейронами, свободно расположенными глиоцитами и суммарной глией ( r= -0,63, p <0,05); гипохромными нейронами и свободно расположенными глиоцитами ( r= -0,57, p <0,05), гипохромными нейронами и суммарной глией ( r= -0,57, p <0,05); умеренная положительная корреляционная связь отмечалась между клетками-тенями и свободно расположенными глиоцитами ( r= 0,5. p <0,05), клетками-тенями и суммарной глией ( r= 0,53, p <0,05).

Во II группе детей, в которую входили новорожденные со сроком внутриутробного развития 38—42 недели, умершие в течение первых суток жизни. Клеточные группировки состояли из 3—8 клеток в сопровождении глиальных клеток и 1—2 сосудов. В 2 случаях клеточные группировки были единичными либо вообще отсутствовали. Форма клеточных группировок была округлой или в виде дорожек. Доля нормохромных нейронов составляла 26 % (Me=231,3±55,2/мм²), гиперхромных несморщенных – 39 % (Me=95,5±50,3/мм²), клеток– теней – 8,5 % (Me=20,1±19,1/мм²), гиперхром-ные сморщенные и гипохромные нейроны присутствовали в единичных случаях. Среди всей популяции глиальных клеток преобладали сателлитные глиоциты, составлявшие 93,3 % (Me=422,5±75,4/мм²). 1 нейрон контактировал на плоскости среза в среднем с 2 глиоцитами (НГИ Me=1,9±0,6). Корреляционный анализ зависимости между нейронами и глиальными клетками во II группе показал сильную положительную корреляционная связь между общим количеством нейронов и нейроглиальным индексом (r=0,7, p<0,05) и умеренную положительную связь между содержанием гиперхром- ных несморщенных нейронов и нейроглиальным индексом (r=0,50, p<0,05).

В IV группе, которую составляли дети со сроком гестации 38—42 недель, умершие в первые сутки жизни, количество клеток было 3—9, в 1 случае достигало 15 клеток, форма клеточных группировок была округлой или овальной. Отмечалось наличие нормохромных, гиперхромных несморщенных и гиперхромных несморщенных нейронов, присутствовали клетки-тени. На долю нормохромных клеток приходилось 13 % (Ме=30,1±20,1/мм2), гиперхромные несморщенные клетки составляли 56 % (Me=130,7±100,6/мм²) от общей численной плотности нейронов, а гипохромные сморщенные, гипохромные и клетки-тени встречались в единичных случаях. Сателлитные глиоциты составляли 76,7 % ( Me =377,2±85,5/мм2). На 1 нейрон на единицу площади среза приходилось 2 глиоцита (НГИ Me =2,1±0,4).

В IV группе умеренная положительная корреляционная связь выявлялась между общей численностью нейронов и сателлитарной глией ( r= 0,68, p <0,05), содержанием гиперхромных несморщенных нейронов и нейронов, окруженных глией ( r= 0,57, p <0,05), содержанием гипер-хромных несморщенных нейронов и нейроглиальным индексом ( r= 0,54, p <0,05), содержанием клеток-теней и свободных глиоцитов ( r= 0,50; p <0,05), клеток-теней и суммарной глией ( r= 0,53, p <0,05). Сильная положительная корреляционная связь наблюдалась между общей численностью нейронов и нейронами, окруженными глией; общей численностью нейронов и нейроглиальным индексом ( r= 0,76, p <0,05). Отрицательная умеренная корреляционная связь отмечалась между содержанием гипохромных клеток и свободно расположенных глиоцитов ( r= 0,57, p <0,05), содержанием гипохромных нейронов и суммарной глией ( r= 0, 57, p <0,05).

Морфологическая характеристика клеточных группировок вентрального таламуса у новорожденных, умерших в течение 2—7 суток жизни, со сроком внутриутробного развития 38—42 недели, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии. В V группе, включающей детей, проживших 2—7 суток, количество нейронов в клеточных группировках было 3—9, все они имели округлую форму, сопровождались 1—2 сосудами и глиальными клетками. В 1 случае наблюдалось полное отсутствие клеточных группировок.

Морфологическая характеристика клеточных группировок вентрального таламуса у новорожденных и младенцев, проживших от 8 суток до 2 месяцев, со сроком внутриутробного развития 38—42 недели, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии. В VI группе детей со сроком гес- тации 38—42 недели, умерших в течение первых суток жизни, количество нейронов в клеточных группировках составляло от 3 до 9, группировки были округлой или неправильной формы, в их состав входили 1—2 сосуда и глия. Во всех исследуемых случаях в некоторых полях зрения формирования клеточных группировок не отмечалось. По своему реактивному и деструктивному состоянию по-прежнему встречались нормохромные, гиперхромные несморщенные и гипохромные сморщенные нейроны, клетки-тени. Количество нормохромных нейронов составляло 26 % (Me=30,1±20,1/мм²), клетки-тени, нормохромные и гиперхромные сморщенные нейроны встречались в единичных случаях. Сателлитарные глиоциты составляли 82,6 % (Me=382,2±70,4/мм²). На 3 глиоцита на единице площади среза приходился 1 нейрон. В VI группе не было отмечено корреляционной связи между нейронами и глиальными клетками.

Структурно-функциональная реорганизация вентрального таламуса у плодов, новорожденных и младенцев со сроком внутриутробного развития 28—42 недели, умерших анте-, интранатально и в первые 2 месяца жизни, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии. При оценке результатов морфометрического исследования нейронов по данным дисперсионного анализа (ANOVA Краскела-Уоллиса) статистически значимые различия выявлялись по следующим показателям: 1) общая численная плотность нейронов (критерий H=9,2; p <0,01); 2) содержание нормохромных нейронов (критерий H=13,8; p <0,001); 3) содержание гиперхромных несморщенных нейронов (критерий H=10,5; p <0,01).

При парном сравнительном анализе выявлено, что наибольшая общая численная плотность нейронов отмечалась в таламусе детей III группы, что было в 1,4 раза больше показателей I группы. Наименьшая общая численная плотность нейронов отмечалась в VI группе. ВI группе общая численная плотность была в 1,5 раза больше, чем VI группе. В IV группе общая численная плотность нейронов была меньше, чем в I группе в 1,5 раза. Наибольшее содержание нормохромных нейронов было в V группе: в 2,2 раза больше, чем в I группе. Количество нормохромных нейронов в III, IV, группах было наименьшим. В I группе количество нормохромных клеток больше, чем в III, IV, в 1,3 раза. Количество нормохромных нейронов в IV группе было в 2 раза больше, чем во II группе (табл. 1). Содержание гиперхромных несморщенных нейронов наибольшим было в III и IV группах, а наименьшим - в V группе.

При парном анализе было установлено, что общая численная плотность глиальных клеток была на одинаковом уровне в I, II, III группах (I -482,8±115,6; II - 422,5±75,4; III - 432,5±65,3), в V группе отмечалось самое минимальное количество нейронов по сравнению с другими группами (262,5±92,2), наибольшее количество нейронов имело место в VI группе (509,01±200,3). Наименьшее содержание свободных глиоцитов было выявлено в IV группе, а нейронов, окруженных глиальными клетками, – в I, II и V группах. При этом нейроглиальный индекс статистически значимо не различался между группами. Количество нейронов, окруженных глией, в I, II, VI группах было практически одинаковым, наименьшее количество приходилось на V группу, наибольшее – на III группу.

Таблица 1

Морфометрическая характеристика нейрональной популяции ядер вентрального таламуса (на 1 мм2) погибших детей в исследованных группах (Me±Q)

Группа	ОЧПН	НХН
I группа	231,5±70,4	40,2±30,1
II группа	231,3±55,3	60,3±30,1
III группа	331,9±35,2 **	30,1±25,1
IV группа	231,3±75,4	30,1±20,1 &&&
V группа	171±55,3 **	90,5±35,2 **
VI группа	150,9±35,2 ***	30,1±20,1

Примечание. * - Наличие статистически значимых различий в сравнении с I группой; ** - p<0,01; *** - p<0,001 (критерий Колмогорова-Смирнова). ОЧПН - общая численная плотность нейронов, НХН - количество нормохромных нейронов.

Иммуногистохимическое исследование вентрального таламуса у плодов и детей, умерших анте-, интранатально и в первые 2 месяца жизни, со сроком внутриутробного развития 28—42 недели, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии. При иммуногистохимическом исследовании определялись CD45RA позитивные клетки только в просветах сосудов в мягкой мозговой оболочке, что говорит об отсутствии В-клеток, натуральных киллеров, мононоцитов, субпопуляции Т-клеток в нервной ткани.

Нами не обнаружены научные источники по применению иммуногистохимических методов исследования у детей для исключения энцефалитов головном мозге, что является важным для постановки внутриутробной инфекции. При окраске гематоксилин-эозином и по методу Ниссля были видны очажки лимфоидной инфильтрации в ткани таламуса (периваскуляр-но). Исследования ряда авторов показали, что воспалительные изменения во всей ткани мозга появляются только при выраженной дегенерации нейронов. В нашем исследовании положительное иммунотипирование клеток лимфоидного ряда, экспрессирующих на себе рецепторы

CD45, выявлялось лишь в просветах сосудов мозговой оболочки и отсутствовало непосредственно в нервной ткани. Этот факт подтверждает положение о том, что элементы воспалительного инфильтрата не входят в исследуемые нами клеточные группировки.

Считаем интересным факт функциональных изменений клеток таламуса, которые проявляются в виде преобладания во всех исследуемых группах гиперхромных несморщенных нейронов. В возрасте от 1 недели до 2 месяцев жизни их число занимает более половины (56 и 53 %) от всей численной плотности нейрональной популяции. Подобные находки отмечались авторами на других гипоксически-ишемических моделях (острая гипоксия). Так, В. А. Неговский [6] после 5-минутной тотальной остановки системного кровотока в отдаленном постгипоксическом периоде отмечал появление нейронов с вакуолизированной цитоплазмой и очаги выпадения нейронов. Максимальное содержание гиперхромных несморщенных нейронов отмечается через 14—90 суток после остановки системного кровотока.

Таким образом, при острой и хронической гипоксии нейроны реагируют однонаправленно – снижением функциональной активности. В зависимости от условий функционирования нейроны с начальными признаками гипер- и гипохромии либо становятся нормохромными, либо реактивно изменяются и превращаются в клетки-тени (гипохромные) и сморщенные ги-перхромные. Измененные несморщенные нейроны находятся в защитном парабиотическом состоянии торможения всех метаболических и биосинтетических процессов, их можно рассматривать как объект потенциально корригирующего лечения [6]. Общая численная плотность нейрональной популяции в нашем исследовании изменялась в зависимости от срока гестации и срока жизни. Число гиперхромных несморщенных клеток увеличивалось пропорционально возрасту ребенка и достигало максимума в сроке жизни 8 суток – 2 месяца, в это же время отмечался наибольший нейроглиальный индекс (1 нейрон контактировал с 3 глиоцитами), т. е. протекторное действие глиоцитов наиболее выражено в самом позднем сроке после перенесенной хронической внутриутробной гипоксии.

Таким образом, на основании вышеизложенных фактов можно сделать следующий вывод: в вентральном таламусе у детей с задержкой внутриутробного развития 38—42 недели, проживших 8 суток – 2 месяца, нейроглиальный индекс увеличивается на 14,5 %, объем цитоплазмы нейронов – на 17,3 %, общая численная плотность нейронов снижается на 35,3 %, глиоцитов – на 18,5 % по сравнению с аналогичными показателями у детей с задержкой внутри- утробного развития и нормотрофиками со сроком внутриутробного развития 28—37 недель, умерших антенатально и интранатально. Учитывая функциональную роль таламуса, степень подверженности клеток и их модульных связей условиям гипоксии, следует обратить пристальное внимание на медикаментозную компенсацию гипоксии при беременности для создания приемлемых условий развития нейронов, глиоцитов и их ансамблей.