Цитогенетические эффекты у Allium cepa L. при раздельном и сочетанном действии Cu, Zn и Ni

Интенсификация хозяйственной деятельности и усиление деграда-ционных процессов способны привести к повышению содержания поллютантов, в том числе тяжелых металлов (ТМ), в природных средах. Так, в ряде регионов Российской Федерации загрязнение почв тяжелыми металлами достигает достаточно высоких значений. Наибольшее загрязнение почв (в процентах от обследованной площади) отмечено для Cu (3,8 %) и Ni (2,8 %), по Zn этот показатель ниже (0,2 %) (1).

Токсичность ТМ для живых организмов детерминирована их концентрацией и физико-химическими свойствами, включая миграционную способность и биологическую доступность, что в конечном итоге определяет величину накопления химических элементов в органах и тканях (2). Аккумулируясь в почве, ТМ оказывают влияние на рост и развитие растений (3, 4), а также на состояние почвенной микробиоты (5), что напрямую или косвенно приводит к потерям урожая сельскохозяйственных культур. К настоящему времени установлены основные механизмы закрепления ТМ в твердой фазе почвы (6). Это позволяет разрабатывать мероприятия по снижению содержания ТМ в почвенном растворе и уменьшению риска токсичности для сельскохозяйственных растений. Фитотоксический эффект достаточно хорошо изучен лишь для некоторых металлов (7-9). Недостаток информации о закономерностях формирования ответной реакции биологических систем на воздействие широкого спектра ТМ затрудняет оценку их истинной опасности для животных и растений.

Как правило, экспериментальные исследования проводят на модельных объектах при воздействии одного из металлов в разных, в том числе высоких , концентрациях, чтобы иметь возможность количественно оценить эффект. Вместе с тем в естественных условиях повышенные концентрации металлов, негативно воздействующие на компоненты ценоза, бывают ниже выбранных для опыта. Еще меньшее внимание уделяется полиэлементному воздействию, поскольку в этом случае значительно сложнее прогнозировать риски с учетом возможного взаимовлияния металлов и развития процессов синергизма или антагонизма (10). В исследованиях на проростках ячменя и пшеницы (11) показано уменьшение фи-тотоксического действия ионов Al³⁺ в присутствии ионов Fe³⁺, что, возможно, объясняется индуцированием синтеза белков, аналогичных трансферрину или лактоферрину у животных, органических кислот или белков-фитохелатинов, которые инактивируют ионы Al³⁺. Выявлена сортовая чувствительность ячменя к действию ионов алюминия, которая носит генетический плейотропный характер (12).

Для сельскохозяйственной практики особенно важное значение имеет влияние повышенных концентраций биологически значимых металлов (Сu, Zn) или металлов, проявляющих токсичность даже в малых количествах (Ni). Установлено, что эти элементы обладают выраженными мутагенными свойствами (13-15). Их соединения могут вызывать как кластогенные, так и анеугенные эффекты (включая нарушения процессов митоза и цитокинеза) (16). Индуцированное никелем и цинком подавление митоза объясняется перераспределением энергетических ресурсов клеток (ткани, организма) на синтез металлотионеинов, в то время как ионы меди повышают митотическую активность (17). Обнаружена достоверная корреляция между повреждением ДНК и содержанием меди (18).

Особое внимание уделяется поиску фиторемедиаторов (19, 20), исследованию закономерностей поглощения и распределения тяжелых металлов в различных частях растений (21, 22), в том числе в зависимости от сортовых особенностей (23), изучению селективного транспорта элементов из ризосферы в листья в онтогенезе (24), механизмов детоксикации тяжелых металлов у разных видов растений (25, 26).

Важное значение имеет изучение генотоксичности различных химических веществ по цитогенетическим и морфометрическим параметрам тест-объекта Allium cepa L. (27-29). С использованием этой тест-системы получены данные о токсических эффектах соединений меди, цинка и никеля как самостоятельно (концентрация CuСO₃ — 5 мг/л, ZnCl₂ — 10 мг/л, NiCO₃ — 0,7 мг/л) (17), так и в разных сочетаниях. Отмечено, что при совместном действии ионов металлов на корневую меристему лука репчатого митогенность ткани изменяется, в клетках усиливается белковый синтез.

Как правило, для работы берутся достаточно высокие концентрации металлов. Так, в сообщении Р.Ф. Гариповой (17) они существенно превышали предельно допустимые значения для вод рыбохозяйственного (в 100-1000 раз) и культурно-бытового (более чем в 2 раза) назначений. 184

Изучение эффектов малых концентраций металлов и установление величины их генотоксичности более актуально, поскольку важно не только в научном, но и в практическом аспекте, особенно в случае полиэлементно-го загрязнения. Кроме того, для разных сочетаний элементов отсутствуют данные по коэффициентам антагонизма, что не дает возможности в полной мере определить взаимообусловленный эффект, тогда как синергизм и антагонизм должны учитываться при определении риска воздействия тяжелых металлов на живые организмы.

Мы впервые оценили воздействие меди, цинка и никеля, взятых в концентрациях, соответствующих реальным значениям их предельно-допустимого содержания в воде разного хозяйственного назначения, на цитогенетические параметры Allium cepa L. Такой подход позволил сравнить эффекты ТМ при концентрациях, различающихся в 1000, 100 и 2 раза, и выявить взаимное ингибирование токсического эффекта разных металлов при их сочетанном действии.

Целью нашей работы было изучение влияния меди, цинка и никеля на развитие цитогенетических эффектов в корневой меристеме лука репчатого ( Allium cepa L.) при разных концентрациях металлов, в условиях моно- и полиэлементного загрязнения, а также определение коэффициентов антагонизма .

Методика. Объектом исследования служили растения лука репчатого сорта Штуттгарден ризен. Эксперименты проводили в 4-кратной повторности в лабораторных условиях. Лук-севок одинакового размера (1,5-1,7 см) отбирали по 10 шт. на каждую повторность варианта опыта. Корни лука проращивали в дистиллированной воде (контроль), растворах Cu(NO₃)₂•3H₂O; Zn(NO₃)₂•6H₂O и Ni(NO₃)₂•6H₂O. При изучении сочетанного действия раствор для проращивания содержал одновременно ионы Zn²⁺ + Ni²⁺, Zn²⁺ + Сu²⁺, Сu²⁺ + Ni²⁺ и Zn²⁺ + Ni²⁺ + Сu²⁺. Концентрации солей соответствовали предельно допустимым значениям в воде рыбохозяйственного назначения (ПДКрх): для ионов Сu — 0,001 мг/л, Ni и Zn — 0,01 мг/л; в воде культурно-бытового назначения (ПДКк-б): для Сu и Zn — 1 мг/л, Ni — 0,02 мг/л.

Анализ хромосомных аберраций проводили в корневой меристеме лука. Для этого через 72 ч от луковиц отсекали корни длиной около 1 см и фиксировали в уксусном спирте (3:1), затем промывали в 80 % спирте. Исследовали временные давленые препараты, окрашенные ацетоорсеином. Учитывали митотический индекс (МИ) — долю клеток, находящихся в стадии митоза, от общего числа клеток в корневой меристеме, а также частоту аберрантных клеток (ЧАК) и типы хромосомных аберраций (30). В каждом варианте просматривали 180-790 ана-телофазных клеток.

Влияние тяжелых металлов оценивали по отклонению усредненных для варианта значений соответствующих показателей от их величин в контроле. Коэффициент антагонизма (АК) рассчитывали по формуле (31): АК = S Me1+Me2 /(S Me1 + S Me2 ), где S Me1+Me2 — доля аберрантных клеток при совместном действии двух металлов за вычетом значения спонтанного фона аберраций (доля аберрантных клеток в контроле); S_Me1 и S_Me2 — доля аберрантных клеток при действии одного из металлов за вычетом значения спонтанного фона аберраций (доля аберрантных клеток в контроле). При действии трех металлов коэффициент антагонизма вычисляли по формуле: АК = S_Me1+Me2+Me3/(S_Me1 + S_Me2 + S_Me3).

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Ехсеl. Достоверность различий между вариантами устанавливали на основе парного двухвыборочного t-теста для средних. В таблицах представлены средние значения (Х) и стандартная ошибка средней (±х).

Результаты. Установлено, что ионы Сu, Zn и Ni, присутствовавшие в растворе для проращивания, в разной степени подавляли деление клеток корневой меристемы лука (табл. 1).

1. Цитогенетические показатели при действии Сu, Znи Ni в разном сочетании на корневую меристему лука репчатого ( Allium cepa L.) ( Х ± х )

Вариант	Число просмотренных ана-телофазных клеток	Частота аберрантных клеток, %	Митотический индекс, %	Тип хромосомной аберрации
	Вода рыбохозяйственного назначения
Сu	725±7	3,10±0,39a, б	14,53±0,58б, г, д	m, f
Zn	500±5	2,72±0,46a, б, д	10,91±0,41a, д	m, f
Ni	424±4	4,23±0,60 a, в, г, д	10,43±0,38a, г, д	m, f
Сu + Zn	585±6	1,78±0,21	9,91±0,48	m, f
Zn + Ni	550±5	2,58±0,51	12,41±0,66	m, f, 3p
Ni + Сu	279±3	2,92±0,49	7,82±0,65	m, f
Сu + Zn + Ni	571±6	2,82±0,34	9,09±0,47	m, f
Контроль	781±8	0,58±0,23	15,12±0,73	m
	Вода культурно-бытового назначения
Сu	314±4	6,56±0,82 a, б, г, д	7,24±0,46a, г	m, f
Zn	333±3	5,16±0,90 a, б, г, д	8,77±0,41a, д	m, f, 3p
Ni	438±4	7,76±1,37a, г, д	9,96±0,40a, в, г, д	m, f, g
Сu + Zn	391±4	3,03±0,20	8,97±0,45	m, f
Zn + Ni	324±3	3,04±0,39	7,35±0,34	m, f
Ni + Сu	177±2	3,83±0,80	6,32±0,42	m, f
Сu + Zn + Ni	347±4	3,85±0,54	7,13±0,40	m, f
Контроль	781±8	0,58±0,23	15,12±0,73	m

П р и м еч а ни е. Использованы концентрации, равные предельно допустимым в воде рыбохозяйственного (ПДКрх) и культурно-бытового (ПДКк-б) назначения. ПДКрх: Сu — 0,001 мг/л, Zn — 0,01 мг/л, Ni — 0,01 мг/л; ПДКк-б: Сu — 1 мг/л, Zn — 1 мг/л, Ni — 0,02 мг/л; контроль — дистиллированная вода; f — фрагмент, m — мост, g — отставание, 3p — трехполюсность.

а, б, в, г Различия достоверны при р < 0,05 по отношению соответственно к контролю, вариантам Сu + Zn, Zn + Ni, Ni + Сu и Сu + Zn + Ni.

Генотоксический эффект эссенциальных для растений металлов (меди и цинка), был достаточно близким, а никеля — существенно выше: ЧАК (%) в корневой меристеме лука при концентрации Сu 0,001 мг/л повысилась в 5,3 раза по сравнению с контролем, при концентрации Zn 0,01 мг/л — в 4,7 раза (см. табл. 1). При увеличении концентрации Сu и Zn до 1 мг/л (ПДКк-б) ЧАК возрастала по сравнению с контролем соответственно в 11,3 и 8,9 раза (см. табл. 1). Для никеля отмечали повышение ЧАК в 7,3 и 13,4 раза при ПДКрх и ПДКк-б.

При увеличении концентраций солей металлов в растворе для проращивания с ПДКрх до ПДКк-б наблюдалось уменьшение МИ. Для Сu МИ снижался в 2,0 раза, для Zn — в 1,3 раза, для Ni различия оказались несущественными (10,43±0,38 и 9,96±0,40 соответственно для ПДКрх и ПДКк-б). То есть изменения МИ были непропорциональны увеличению содержания металла в растворе. Аналогичные явления наблюдали и в отношении других металлов, например Cd (32, 33).

Действие солей ТМ на растения носит комплексный характер с широким спектром мишеней, чем и объясняются разнообразные нарушения, фиксируемые на всех уровнях организации биологического объекта (17, 34). Цинк и медь относятся к наиболее важным биоактивным (эссенциальным) химическим элементам и участвуют в различных метаболических процессах. Роль никеля менее изучена. Как правило, он рассматривается в качестве токсичного элемента для большинства растений (8), подтверждено его участие в некоторых ферментативных реакциях у бобовых. Большинство видов растений обладают высокой толерантностью к избытку солей металлов в почвах благодаря механизмам ограничения поступления металлов и их детоксикации в клетках. В лабораторных исследованиях показано, что ТМ в концентрации 10^-6-10^-3 M вызывают цитогенетические нарушения в клетках апикальной меристемы Allium cepa L. (16). Рейтинг 186

солей ТМ по способности индуцировать хромосомные аберрации представлен рядом ZnSO 4 > Pb(CH 3 COO) 2 > Al(NO 3 ) 3 = NiSO 4 > CdCl 2 > CuSO 4 . При этом наиболее сильный антимитотический эффект отмечали у Ni (почти в 70 раз по сравнению с контролем увеличивался процент отставания хромосом, мультиполярных анафаз, К-митозов). Ионы Ni также оказались самым сильным индуктором нарушения цитокинеза (16). В наших исследованиях только для никеля в концентрациях, равных ПДКк-б, было выявлено отставание хромосом (см. табл. 1). На стадии анафазы и телофазы мы наблюдали два типа аберраций — ацентрические фрагменты и мосты.

Присутствие в растворе для проращивания корешков лука одновременно двух металлов уменьшало токсический эффект каждого из них. В вариантах, где раствор содержал ионы меди, частота аберраций хромосом в присутствии цинка достоверно снижалась в 1,7 и 2,2 раза (соответственно для ПДКрх и ПДКк-б) по сравнению с ЧАК для меди. В сочетании меди с ионами никеля ЧАК уменьшалась менее значимо — в 1,06 и 1,70 раза. При одновременном действии Сu, Zn и Ni в концентрациях, равных ПДКрх, ЧАК либо не достигала значений при раздельном действии металлов (для Сu и Ni), либо оказывалась сопоставимой с ними (для Zn) (см. табл. 1). При ПДКк-б и сочетанном воздействии металлов ЧАК всегда была ниже значений при их раздельном воздействии (см. табл. 1). ЧАКNi и ЧАКCu+Zn+Ni различались в 2 раза.

2. Коэффициент антагонизма при действии Сu, Zn и Ni в разном сочетании на корневую меристему лука репчатого ( Allium cepa L.)

Вариант 1 ПДКрх ПДКк-б Сu + Zn 0,31 0,26 Zn + Ni 0,37 0,24 Ni + Сu 0,40 0,27 Сu + Zn + Ni 0,28 0,20 П р и м е ч а н и е. Использованы концентрации, равные пре- дельно допустимым в воде рыбохозяйственного (ПДКрх) и культурно-бытового (ПДКк-б) назначения. ПДКрх: Сu — 0,001 мг/л, Zn — 0,01 мг/л Коэффициент антагонизма рассчитан по частоте аберрантных клеток.

Для ПДКрх митотический индекс при сочетанном эффекте металлов был ниже МИ при раздельном воздействии, кроме МИZn+Ni, когда наблюдали увеличение показателя как по сравнению с МИZn, так и МИNi. Напротив, для ПДКк-б изменения МИ при парном сочетании металлов колебались, а в при- сутствии трех металлов (Сu, Zn и Ni) МИ был ниже, чем для Zn или Ni. Такие различия в реакции на раздельное и совместное присутствие метал- лов в растворе свидетельствуют о конкурентном действии ионов металлов (34). При этом в паре Zn + Ni (ПДКрх) появился новый тип хромосомных нарушений — трехполюсность. При росте концентрации металлов до значений ПДКк-б трехполюсность отмечали только для Zn.

Значения коэффициентов антагонизма, рассчитанных по ЧАК (табл. 2), при ПДКк-б колебались от 0,20 (для Сu + Zn + Ni) до 0,27 (для Ni + Сu). При ПДКрх этот показатель составлял от 0,28 (для Сu + Zn + Ni) до 0,40 (для Ni + Сu). Следует отметить, что независимо от концентраций наибольшее и наименьшее значения коэффициента антагонизма были характерны для одних и тех же компонентов смеси металлов.

Таким образом, установлено генотоксическое действие ионов тяжелых металлов на клетки корневой меристемы лука репчатого Allium cepa L. при концентрациях элементов, соответствующих значениям ПДК в воде рыбохозяйственного и культурно-бытового назначений. Даже при относительно невысоких концентрациях металлов (Сu — 0,001 мг/л, Ni и Zn — 0,01 мг/л) частота аберрантных клеток по сравнению с контролем увеличивалась примерно в 3-7 раз. В случае сочетанного действия ионов металлов наблюдалось взаимное ингибирование эффектов, наиболее выраженное в варианте Сu + Zn. Повышение количества металлов до ПДКк-б увеличивало показатели генотоксичности до 2-кратных значений, но не было про- порционально возрастанию концентрации элементов. При этом спектр аберраций хромосом для эссенциальных (Cu, Zn) и токсичного (Ni) элементов оказался различным: для никеля при ПДКк-б выявлено отставание хромосом. Значения коэффициентов антагонизма (по частоте аберрантных клеток) при ПДКк-б колебались в зависимости от сочетания металлов. Выявленные закономерности раздельного и комбинированного действия металлов на корневую меристему должны учитываться при мониторинге как водных экосистем, так и почвенных биоценозов, подвергающихся сочетанному действию тяжелых металлов, а также при оценке экологического риска для различных типов экосистем, испытывающих полифакторное влияние химических элементов.