Цитологические особенности мононуклеарных лейкоцитов, культивированных в присутствии полиаминов

Разносторонние биологические эффекты действия полиаминов на функции и жизнедеятельность как прокариотических, так и эукариотических клеток [Годовалов, Карпунина, 2022] обусловливают нарастающий интерес к их изучению. Известно, что полиамины регулируют синтез белка бактериями, их устойчивость к антимикробным препаратам, формирование биопленок, quorum sensing и т.д. [Бухарин, 2018, Нестерова, Негорелова, Ткаченко, 2019]. Показано, что применение путресцина per os приводит к увеличению активности лизоцима и щелочной фосфатазы, уровня иммуноглобулинов М, а также снижает уровень продукции фактора некроза опухоли-α в кишечном содержимом [Liu et al., 2019]. Кроме того, установлено, что полиамины регулируют дифференцировку макрофагов в М2 и оказывают супрессию толерогенных дентритных клеток [Carriche et al., 2021]. В ряде других экспериментов описано ингибирование путресцином и кадаверином продукции IFNγ, а также увеличение продукции IL-4 митоген-активированными клетками [Годовалов и др., 2019]. Продемонстрировано участие полиаминов в регуляции активации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов [Hesterberg, Cleveland, Epling-Burnette, 2018]. Так, дефицит орнитиндекарбоксилазы, фермента, необходимого для синтеза полиаминов, приводит к нарушению дифференцировки CD4⁺ Т-хелперов из-за снижения концентрации субстрата для дезоксигипузин-синтазы [Puleston et al., 2021]. Ранее было показано, что в очаге воспаления, там, где наблюдается активное размножение условно патогенных микроорганизмов, нарастает уровень полиаминов [Shah et al., 2011; Морозов, Карпунина, Годовалов, 2018; Годовалов, Карпунина, 2022]. Однако изменение активности клеток иммунной системы в таких условиях не изучено. В связи с этим наибольшее внимание исследователей привлекают полиамины, синтезируемые условно патогенными микроорганизмами, как, например, путресцин и кадаверин. Эти полиамины относятся к классу низкомолекулярных алифатических поликатионных аминов, состоящих из насыщенных углеводородных цепей различной длины с аминогруппами [Hesterberg, Cleveland, Epling-Burnette, 2018]. Известно, что полиамины могут активно проникать через цитоплазматическую мембрану клеток при участии специфического переносчика [Mei et al., 2007; Kurihara, 2022] и (или) за счет пассивной диффузии [Силачев, Плотников, Горюнов, 2018]. После проникновения полиаминов в клетку наблюдается процесс их связывания с полианионными соединениями (белки, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды, глюкозаминогликаны), а более 90% всех полиаминов находятся в связанном с ДНК и РНК состоянии [Mei et al., 2007; Hesterberg, Cleveland, Epling-Burnette, 2018]. Внутриклеточные функции полиаминов многообразны: стабилизация плазматических мембран, суперсперилизация структуры ДНК, индуцирование транскрипции, связывание с рибосомами, активация ДНК-лигаз, эндонуклеаз, протеинкиназ. Связавшись с нуклеиновыми кислотами, полиамины влияют на структуру хроматина, регулируя тем самым экспрессию генов [Shah, Swiatlo, 2008]. Однако исследований морфологических особенностей эукариотических клеток относительно мало.

Цель исследования – оценка изменений цитологических характеристик лейкоцитов после их инкубации с кадаверином и путресцином.

Материалы и методы

У практически здоровых доноров брали пробы венозной крови с последующим выделением моно-нуклеарной фракции лейкоцитов путем центрифугирования на градиенте плотности фикола-верографина (1.077 г/см³). Рабочее количество лейкоцитов – 200 мононуклеарных клеток на 1 мкл. В стерильные круглодонные планшеты внесли полиамины в концентрациях 5 и 25 ммоль/л. Использовали путресцина гидрохлорид, кадаверина гидрохлорид. В контрольные лунки вносили равный объем среды. Использовали полную культуральную среду, включающую RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES , 0.05 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L -глютамина. Культивирование осуществляли в следующих условиях: влажная атмосфера с 5%-ным СО 2 при 37ºС в течение 72 ч. После этого готовили микропрепараты из клеточного осадка и фиксировали их по методу Май-Грюнвальда с последующей окраской по методу Романовского – Гимза. В препаратах учитывали типы клеток, определяли их размеры, а также наличие вакуолей и включений.

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью парного варианта t -критерия Стьюдента. За пороговый уровень значимости принимали величину p <0.05.

Результаты

Установлено, что по мере увеличения концентрации путресцина в пробах, общее количество моно-нуклеарных лейкоцитов не увеличивается относительно аналогичного показателя в контрольных пробах, что, возможно, обусловлено ингибированием пролиферативной активности этих клеток путресцином. При этом существенных различий между пробами с 5 и 25 ммоль/л не выявлено (рис. 1). В случае культивирования клеток в присутствии кадаверина выявлено увеличение численности моноцитов. При этом в пробах с 5 ммоль/л наблюдается незначительное увеличение их числа, а с увеличением концентрации кадаверина – статистически значимое отличие от контрольных проб (рис. 1). Кроме того, численность клеток в пробах с 5 и 25 ммоль/л кадаверина статистически значимо различалась.

концентрация полиаминов, ммоль/л

□ путресцин        □ кадаверин

Рис. 1. Численность мононуклеарных клеток в пробах с полиаминами к 72 ч культивирования.

* – p <0.05 при сравнении кадаверина и путресцина; # – p <0.05 при сравнении с пробами без соответствующего полиамина. Результаты представлены в виде среднего арифметического и его ошибки

[The number of mononuclear cells in samples with polyamines by 72 hours of cultivation.

* – p<0.05 when comparing cadaverine and putrescine; # – p<0.05 when comparing with samples without the corresponding polyamine. The results are presented in the form of an arithmetic mean and its error]

С помощью окрашивания трипановым синим в пробах с разными концентрациями путресцина не выявлено снижения числа жизнеспособных клеток, а также увеличения числа мертвых клеток. При этом в микропрепаратах наблюдается увеличение относительного числа клеток с признаками цитолиза согласно повышению уровня путресцина. При концентрации этого поликатиона 5 ммоль/л – 4.6±0.6%, а при 25 – 5.8±0.6% (в контрольных пробах – 2.6±0.7%, p = 0.051 к пробам с 5 ммоль/л и p = 0.032 к пробам с 25 ммоль/л путресцина).

К 72 ч культивирования клеток с путресцином установлено, что с увеличением концентрации этого поликатиона увеличивается доля моноцитарных клеток, а численность лимфоцитов снижается относительно аналогичных показателей в образцах без полиаминов (рис. 2).

концентрация путресцина, ммоль/л

• □ моноциты □ лимфоциты

Рис. 2. Лимфоцитарно-моноцитарное соотношение при культивировании клеток в присутствии путресцина.

• * – p <0.05 при сравнении кадаверина и путресцина; # – p <0.05 при сравнении с пробами без соответствующего полиамина. Результаты представлены в виде среднего арифметического и его ошибки

[Lymphocyte-monocyte ratio in cell culture in the presence of putrescine.

* – p<0.05 when comparing cadaverine and putrescine; # – p<0.05 when comparing with samples without the corresponding polyamine. The results are presented in the form of an arithmetic mean and its error]

При увеличении уровня путресцина в пробах возрастало количество больших по размеру лимфоцитов до 22.1±2.4% при 5 ммоль/л и 34,5±2.9% при 25 ммоль/л (в контроле – 5.3±1.7%, p = 0.001 к пробам с 5 и 25 ммоль/л). Отмечено дозозависимое увеличение клеток, содержащих вакуоли: 20.2±2.3% при 5 ммоль/л; 33.4±1.4% при 25 ммоль/л (в контроле – 10.9±1.5%; p = 0.001 к пробам с 5 и 25 ммоль/л). Однако число клеток, содержащих прочие включения, оставалось наименьшим при 25 ммоль/л (18.9±1.2%) и наибольшим – в контрольных пробах (41.6±7.9%; p = 0,049).

При подсчете клеток с трипановым синим в пробах с разными концентрациями кадаверина установлено увеличение числа жизнеспособных клеток при повышении концентрации этого поликатиона. В микропрепаратах, полученных из культуральной взвеси после 72 ч инкубации в присутствии 25 ммоль/л кадаверина число клеток с признаками цитолиза существенно меньше, чем таковое в контрольных пробах (1.3±0.2 и 3.7±0.6% соответственно; p = 0.02). Изменения лимфоцитарно-моноцитарного соотношения в пробах мононуклеарных лейкоцитов, культивированных в присутствии разных концентраций кадаверина, представлены на рис. 3.

концентрация кадаверина, ммоль/л

□ МО ноциты       □ лимфоциты

Рис. 3. Лимфоцитарно-моноцитарное соотношение при культивировании клеток в присутствии кадаверина.

* – p <0.05 при сравнении между кадаверином и путресцином; # – p <0.05 при сравнении с пробами без соответствующего полиамина. Результаты представлены в виде среднего арифметического и его ошибки

[Lymphocyte-monocyte ratio in cell culture in the presence of cadaverine.

* – p<0.05 when compared between cadaverine and putrescine; # – p<0.05 when compared with samples without the corresponding polyamine. The results are presented in the form of an arithmetic mean and its error]

Отмечено значительное уменьшение количества малых лимфоцитов (до 9.0±0.8%) и повышение лимфоцитов большого размера (до 20.9±1.0%) при уровне кадаверина 25 ммоль/л (в контрольных пробах – 22.3±1.0%, p = 0.001 и 9.6±0.9%, p = 0.001 соответственно). Кроме того, в пробах с 25 ммоль/л кадаверина выявлено значимое увеличение доли клеток, содержащих вакуоли и включения – 26.9±3.0% (в контроле – 9.5±1.6%, p = 0.001).

Обсуждение

Известно, что в метаболизме моноцитарно-макрофагальных клеток существенное значение играют полиамины, однако большинство исследователей сконцентрированы на изучении влияния спермина и спермидина, являющихся продуктами эукариотических клеток. Кроме этого, есть сведения, что концентрация полиаминов увеличивается при воспалении, особенно в случае наличия полиамин-синтезирующих видов бактерий, среди которых следует выделить представителей семейства Enterobacte-riaceae , рода Neisseria и других [Tabor, Tabor, 1985; Lavizzari et al., 2010]. Однако эти виды микроорганизмов синтезируют другие поликатионы – кадаверин и путресцин, о влиянии которых на иммунокомпетентные клетки относительно мало сведений.

Путресцин оказывает большее влияние на моноциты, чем кадаверин, поскольку может включаться в метаболизм этих клеток с последующим образованием спермина и спермидина [Kurihara, 2022]. Известно, что рост числа клеток с вакуолями среди моноцитов может указывать на их активацию [Сидельников, Начева, 2016; Бархина, Гущин, Алексеев, 2018; Kurihara, 2022], которая, как показано в настоящем исследовании длится дольше, поскольку число клеток с включениями существенно не изменяется. Кроме того, в проведенных ранее исследованиях установлено, что путресцин оказывает преимущественное влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов, но не моноцитов [Годовалов и др., 2019].

Зарегистрированное повышение числа жизнеспособных клеток при их инкубации с кадаверином обусловлено протективным действием этого полиамина при наличии факторов, инициирующих цитолиз клеток, что можно наблюдать в искусственных условиях. Увеличение числа клеток с включениями можно рассматривать как отражение увеличения поглотительной активности моноцитов, что подтверждается проведенными нами ранее исследованиями [Морозов, Карпунина, Годовалов, 2018; Годовалов и др., 2019].

Наблюдаемая в настоящем исследовании вакуолизация цитоплазмы, вероятно, не является признаком развивающейся клеточной смерти, а относится к побочным эффектам действия полиаминов [Shubin, Demidyuk, Komissarov, 2016]. От эндоплазматического ретикулюма отщепляются вакуоли, что повышает емкость этого органоида, в том числе для белка. Более того вакуоли аккумулируя бактериальные токсины снижают их патогенный эффект (например, токсины E. coli Stx2 и SubAB, токсин M. pneumoniae CARDS и некоторые другие [Shubin, Demidyuk, Komissarov, 2016]). Можно предположить, что такая ситуация будет способствовать внутриклеточной персистенции бактерий-продуцентов полиаминов.

Заключение

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что кадаверин и путресцин, продуцируемые преимущественно прокариотическими клетками, оказывают влияние как на численность, так и на цитологические характеристики иммунокомпетентных клеток.