Цитоморфологические и биохимические показатели у крыс линии Wistar под влиянием молибденсодержащих наночастиц

Наноформы молибдена широко применяются в современных технологиях (1, 2), в том числе при многофункциональном электрокатализе (3), производстве смазочных материалов (4). Кроме того, ультрадисперс-ные препараты молибдена и его соединений обладают уникальными биологическими свойствами, что позволяет использовать их при терапии опухолей (5), в качестве противомикробных (6, 7) и противогрибковых средств (8), для стимулирования роста синезеленых водорослей (9).

Молибден как эссенциальный микроэлемент хорошо изучен. Известно об его участии в ферментативных системах (10). Описаны диапазоны дефицита, достаточности и токсичности молибдена (11). Известны фоновые (12), пороговые и токсические концентрации молибдена для беспозвоночных в почвах (13). Однако сведения о последствиях взаимодействия вновь создаваемых молибденсодержащих наноматериалов с биологически-

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 14-36-00023). Исследования проводились в лаборатории «Агроэкология техногенных наноматериалов» и Испытательном центре (ФГБНУ Всероссийский НИИ мясного скотоводства, аттестат аккредитации RA. RU.21ПФ59 от 02.12.15). Анализ образцов на содержание химических элементов проводили в лаборатории АНО «Центр биотической медицины», г. Москва (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦАО.311, Регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU. 0001.513118).

ми объектами все еще крайне ограничены. Между тем поисковые исследования свидетельствуют о том, что биологические эффекты наноформ молибдена значительно более выражены. Это показано на различных моделях. В частности, поступление наночастиц оксида молибдена в почву приводит к высокой смертности, адаптационным изменениям активности антиоксидантных ферментов и депрессии обмена Cr, Fe, Mg, Mn, Ni, Si, V у Eisenia fetida (14). Присутствие наночастиц молибдена в водной среде сопровождается нарушением проницаемости клеточной мембраны у Styl-onychia mytilus и процессами, сопутствующими повреждению (15). Анализ накопленных данных о биологических эффектах молибденсодержащих наночастиц позволяет предположить наличие у них токсического действия в отношении теплокровных животных.

Мы впервые сравнили биологические эффекты наночастиц молибдена и его оксида в отношении теплокровных животных (крыс).

Цель работы заключалась в изучении морфологических и биохимических показателей крови, морфофункциональных характеристик тканей и обмена химических элементов у модельных объектов под влиянием наночастиц молибдена и его оксида.

Методика . Наночастицы (НЧ) молибдена (Mo НЧ) и оксида молибдена (MoO₃ НЧ) получали методом плазмохимического синтеза (ООО «Платина», г. Москва). Препараты Мо НЧ (d = 50 нм, удельная поверхность 14 м²/г, Z-потенциал - 43±0,52 мВ) содержали 99,7 % Мо и 0,3 % O_2, МоО₃ НЧ (d = 92 нм, удельная поверхность 12 м²/г, Z-потенциал - 43±0,21 мВ) — 99,8 % Мо и 0,2 % O₂. Материаловедческая аттестация препаратов (определение размера частиц, полидисперсности, объемности, содержания фракций, площади поверхности) включала электронную сканирующую, просвечивающую и атомно-силовую микроскопию с использованием LEX T OLS4100, JSM 7401F и JEM-2000FX («JEOL», Япония). Распределение частиц по размерам исследовали на анализаторе Photocor Compact (ООО «Фотокор», Россия). Препараты наночастиц диспергировали в физиологическом растворе с помощью УЗДН-2Т («НПП Академпри-бор», Россия) (35 кГц, 300 Вт, 10 мкА, 30 мин).

Исследования проводили на 75 белых крысах-самцах линии Wistar массой 150-180 г в стандартных условиях вивария (экспериментальнобиологическая клиника, Оренбургский государственный университет). Рацион животных (ГОСТ Р 50258-92) соответствовал правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Эксперименты выполняли в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009), а также согласно рекомендациям «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)». После подготовительного периода (1 мес) животных разделили на пять групп (в каждой n = 15). Однократно внутрибрюшинно животным в I и II группах вводили Mo НЧ в дозах соответственно 1 и 25 мг/кг живой массы, в III и IV группах — MoO₃ НЧ в дозах соответственно 1,2 и 29 мг/кг. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Биоматериал для исследования получали после декапитации крыс под нембуталовым наркозом (5 особей в каждом варианте опыта и в контроле через 1, 7 и 14 сут после введения нанопрепаратов). Кровь для определения морфологических показателей отбирали в вакуумные пробирки с добавлением антикоагулянта, для биохимических показателей — в вакуумные пробирки с активатором свертывания (тромбин). Морфологический 930

состав крови и количество гемоглобина определяли на автоматическом гематологическом анализаторе URIT-2900 Vet Plus ( « URIT Medical Electronic Group Co., Ltd», Китай). Биохимический анализ сыворотки крови выполняли на автоматическом анализаторе CS-T240 ( « DIRUI Industrial Co., Ltd», Китай) с коммерческими наборами для ветеринарии (ДиаВетТест, ЗАО «ДИАКОН-ДС», Россия; «Randox Laboratories Ltd», Великобритания). Содержание химических элементов в исследуемых образцах определяли на масс-спектрометре Elan 9000 и атомно-эмиссионном спектрометре Optima 2000V («Perkin Elmer», США). Для озоления использовали микроволновую систему разложения Multiwave 3000 («Anton Paar», Австрия).

При изучении микроструктуры печени образцы фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафиновую смесь HISTOMIX® (ООО «БиоВитрум», Россия). Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм готовили на полуавтоматическом микротоме (МЗП 01, «Техном», Россия), окрашивали гематоксилином Майера и эозином и просматривали под световым микроскопом MT 5300L («Meiji Techno Co., Ltd», Япония, ½400).

Данные представлены как среднее ( M ) и стандартная ошибка среднего ( m ). Статистический анализ выполняли с использованием методик ANOVA (программный пакет Statistica 10.0, «StatSoft Inc.», США) и Microsoft Excel. Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t -критерию Стьюдента. Достоверными считали значения при Р < 0,05.

Результаты. При введении наночастиц молибдена и его оксида уже на 1-е сут эксперимента отмечали достоверные морфологические изменения крови (табл. 1). Так, содержание лейкоцитов во II и IV группах снижалось на 11,3 % (Р < 0,05) и 58,5 % (Р < 0,01).

• 1.    Динамика морфологических показателей крови у крыс линии Wistar после внутрибрюшинного введения наночасти (НЧ) Мо и MoO₃ в разных дозировках ( M ± m , n = 75)

• 2.    Динамика биохимических показателей крови у крыс линии Wistar после внутрибрюшинного введения наночасти (НЧ) Мо и MoO3 в разных дозировках (M±m, n = 75)

Показатель	Контроль	Мо НЧ		МоО 3 НЧ
		I группа	II группа	III группа 1	IV группа
		В 1-е сут
Лейкоциты, ½109/л	8,80±0,180	8,85±0,095	7,90±0,080	7,25±0,550	6,55±0,150
Эритроциты, ½1012/л	8,59±0,120	8,90±0,155	8,65±0,155	9,50±0,380	8,52±0,165
Гемоглобин, г/л	172,5±1,50	189,5±5,50	162,5±4,50	184,0±6,00	133,5±1,50
Тромбоциты, ½109/л	170,50±9,500	176,00±12,000	250,00±5,130*	188,50±6,500	184,50±6,500
Лимфоциты, ½109/л	4,10±0,010	3,75±0,015	4,35±0,015	2,90±0,030	2,30±0,090
Моноциты, ½109/л	2,20±0,090	1,85±0,050*	1,55±0,035*	1,45±0,035**	1,20±0,070**
Гранулоциты, ½109/л	2,50±0,090	3,25±0,015*	2,00±0,050	2,90±0,090*	2,05±0,055
		Н а 7-е сут
Лейкоциты, ½109/л	7,10±0,120	6,50±0,160	7,85±0,195	6,60±0,110	7,95±0,450
Эритроциты, ½1012/л	8,12±0,430	7,60±0,360	7,43±0,110	6,62±0,230	7,55±0,050
Гемоглобин, г/л	165,0±10,20	156,0±6,00	143,0±3,00	126,0±5,0	145,0±8,0
Тромбоциты, ½109/л	159,5±3,50	162,0±8,00	182,5±2,50*	183,0±8,00	179,5±7,50
Лимфоциты, ½109/л	3,80±0,01	3,50±0,07	3,70±0,09	2,90±0,01*	3,40±0,07
Моноциты, ½109/л	2,10±0,210	2,35±0,150	2,65±0,300	1,95±0,020	1,40±0,060*
Гранулоциты, 109/л	2,50±0,090	1,65±0,035	2,50±0,070	2,75±0,085	3,15±0,015*
		Н а 14-	е сут
Лейкоциты, ½109/л	8,15±0,350	8,95±0,150	8,75±0,150	6,26±0,043	7,95±0,250
Эритроциты, ½1012/л	8,78±0,430	8,62±0,165	6,86±0,105	5,91±0,139	6,76±0,160
Гемоглобин, г/л	166,5±9,50	157,5±5,50	122,5±5,50	108,8±5,25	128,0±8,00
Тромбоциты, ½109/л	188,5±7,50	154,5±3,50	352,0±6,00**	149,88±5,13	311,5±9,50**
Лимфоциты, ½109/л	4,50±0,012	3,05±0,015	2,20±0,020	2,10±0,099	2,75±0,035
Моноциты, ½109/л	2,55±0,015	2,05±0,015	2,10±0,012	2,42±0,038	1,65±0,015*
Гранулоциты, ½109/л	2,10±0,020	3,85±0,025	4,45±0,035	4,74±0,066	3,55±0,045

П р и м е ч а н и е. I и II группы — дозы соответственно 1 и 25 мг/кг живой массы, III и IV группы — 1,2 и 29 мг/кг.

*, ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05 и Р < 0,01.

Особенностью действия содержащих молибден наночастиц оказалось уменьшение числа моноцитов в 1-е сут на 18,9 (Р < 0,05); 41,9 (Р < 0,01); 51,7 (Р < 0,05) и 83,3 % (Р < 0,001) соответственно в I, II, III и IV груп- пах. Через 7 сут эта разница составила 55,6 (Р < 0,05); 27,3 (Р < 0,05); 7,7 и 50,0 % (Р < 0,05). К завершению эксперимента достоверные различия сохранились только между контрольной и IV группами (54,5 %, Р < 0,05). Обнаруженные нами эффекты наночастиц в отношении моноцитов кардинально отличались от описанных для наночастиц полистирола (16) и наноформ меди и железа (17). Аналогичная динамика была характерна для лимфоцитов, число которых в крови животных из IV группы снизилось в 1-е сут на 78,6 % (Р < 0,001), на 14-е — на 63,6 % (Р < 0,001). В остальных группах достоверное снижение содержания лимфоцитов происходило только на 14-е сут. О сходной динамике числа лимфоцитов у человека при ингаляционном поступлении оксида молибдена сообщалось ранее (18).

На 7-е и 14-е сут после введения наночастиц у крыс проявлялись признаки молибденовой интоксикации (снижение содержания эритроцитов и гемоглобина), сильнее выраженной для MoO3 НЧ, что обусловлено более высокой токсичностью оксида по сравнению с металлом (19).

В группах, получавших наибольшие дозировки наночастиц молибдена и его оксида, к 14-м сут число тромбоцитов увеличивалось, что приводило к сладжированности крови, повышению вязкости и затруднению перфузии через микрососуды. Сходные проявления описаны ранее для молибденсодержащих наночастиц (20, 21).

Мо НЧ МоО 3 НЧ Показатель Контроль I группа 1 II группа III группа IV группа В 1-е сут АлАТ, Е/л 59,75±5,890 97,00±7,000 70,65±3,750 80,12±2,720 44,35±1,550* АсАТ, Е/л 140,50±2,200 434,80±16,500* 452,95±14,950* 376,50±16,600 218,00±17,120 ЛДГ, Е/л 279,00±12,200 232,00±15,700 272,50±10,150 250,00±13,000 324,50±14,500 ГГТ, Е/л Каталаза, мкмоль 1,40±0,014 7,00±0,030* 1,00±0,010 15,00±0,120* 3,00±0,150 Н2О2•л-1•мин-1 2668±104 10983±418 6550±148* 8225±295 5664±231 СОД, % 110,0±5,12 130,0±8,01 128,0±7,81 140,0±2,13* 140,0±3,11* Креатинин, мкмоль/л 48,50±1,200 42,45±1,450 49,95±2,850 44,95±0,850 75,60±1,700** Билирубин, мкмоль/л 5,31±0,025 5,13±0,031 5,25±0,018 25,80±0,640** 19,70±0,920* Мочевина, ммоль/л 5,35±0,051 4,25±0,053 6,30±0,050 4,40±0,070 7,00±0,080** Креатинкиназа, Е/л 2948±220 3556±134 5227±107 2693±114 2902±172 Н а 7-е сут АлАТ, Е/л 67,25±3,450 128,85±17,350 147,60±6,800 111,50±4,800 132,20±3,100 АсАТ, Е/л 148,35±7,450 567,60±19,100 664,95±11,950 531,20±25,700 699,25±13,550 ЛДГ, Е/л 305,50±9,500 374,50±9,500 309,00±11,000 305,00±14,000 433,00±15,800 ГГТ, Е/л Каталаза, мкмоль 1,50±0,050 1,50±0,050 5,00±0,025 2,00±0,100 4,50±0,050 Н2О2•л-1•мин-1 2413±131 3792±147 7486±248 8865±212 22029±931** СОД, % 136,8±16,20 666,2±6,80** 470,4±14,90 367,0±12,00 396,8±3,00* Креатинин, мкмоль/л 47,75±0,650 58,20±1,100 32,15±1,250 44,20±3,500 42,65±3,150 Билирубин, мкмоль/л 5,96±0,042 5,86±0,028 5,49±0,067 8,05±0,040 6,90±0,097 Мочевина, ммоль/л 5,70±0,012 4,15±0,050 5,00±0,100 5,80±0,150 5,55±0,170 Креатинкиназа, Е/л 2726±110 5429±298 4394±115 4278±283 4178±148 Н а 14-е сут АлАТ, Е/л 65,80±4,900 182,50±8,900 242,25±9,750 142,00±8,300 128,60±7,600 АсАТ, Е/л 142,05±11,150 459,70±28,800 629,25±37,850* 147,00±4,280 367,55±15,850* ЛДГ, Е/л 243,00±12,000 236,00±14,000 294,50±8,500 177,88±5,120 291,50±8,500* ГГТ, Е/л Каталаза, мкмоль 1,50±0,050 12,50±0,500 8,50±0,120 1,58±0,042 5,50±0,050 Н2О2•л-1•мин-1 2532±151 4122±195 6846±285 8764±256* 20021±725* СОД, % 130,2±8,84 146,5±12,93 108,1±5,82 94,0±5,05 166,3±2,09* Креатинин, мкмоль/л 42,60±0,140 48,30±0,240 51,40±0,200* 46,07±0,535 77,75±0,650** Билирубин, мкмоль/л 5,64±0,425 5,25±0,545 12,02±0,615 2,40±0,171 4,58±0,125 Мочевина, ммоль/л 5,60±0,016 5,50±0,030 6,00±0,017 4,21±0,099 10,60±0,080* Креатинкиназа, Е/л 2670±68 4090±175 3148±103 3225±118 3971±163 Примечание. I и II группы — дозы соответственно 1 и 25 мг/кг, III и IV группы — 1,2 и 29 мг/кг живой массы. АлАТ, АсАТ, ЛДГ, ГГТ, СОД — аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, лак- татдегидрогеназа, γ-глутамилтрансфераза, супероксиддисмутаза.

*, ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05 и Р < 0,01.

Таким образом, признаки анемии, лейкопении, сладж-феномен, местные воспалительные реакции отражают наступление капиллярно-трофической недостаточности при применении MoO3 НЧ. Поскольку использованные дозы наночастиц молибдена и его оксида сопоставимы, можно сделать вывод, что первые менее токсичны.

Рост активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) у животных свидетельствовал о наличии цитолиза, причем со временем этот процесс усугублялся (табл. 2). Так, по АлАТ и количеству общего билирубина при разнице с контролем в 1-е сут в пределах 18,2-62,0 % на 7-е сут она составила до 119,0 %, на 14-е сут — 272,0 %. В случае АсАТ различия оказались еще заметнее — 222,0-352,0 %; в случае билирубина достоверное увеличение (в 4,8 раза) отмечали уже в 1-е сут для МоО3 НЧ. При максимальной дозировке МоО3 НЧ (29 мг/кг) в 1-е сут регистрировали достоверное (Р < 0,05) снижение активности АлАТ. Это может быть косвенным признаком нарушения клубочковой фильтрации, что подтверждают высокие показатели по креатинину (разница с контролем в 14,3 раза, Р < 0,01) и мочевине (выше на 30,8 %, Р < 0,01).

Мы не обнаружили повышения активности сывороточной γ -глут-амилтрансферазы (ГГТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Показатели, близкие к верхним границам нормы, были зафиксированы в 1-е сут для минимальных дозировок Мо НЧ и MoO₃ НЧ, а также на 7-е и 14-е сут при максимальных дозах обеих наночастиц. Такая динамика активности ГГТ и ЛДГ может свидетельствовать о разрушении мембран незначительной популяции клеток и слабой индукции микросомального окисления под влиянием наночастиц металлов переменной валентности (22). В то же время с увеличением сроков воздействия до 14 сут при минимальной дозе Мо НЧ активность ГГТ повышалась 5-кратно, что может оцениваться как признак окислительного стресса, который способны индуцировать Мо НЧ. Ранее подобное описано на фибробластах мышей (линия L929) при генерации активных форм кислорода на фоне снижения количества глутатиона и активности каталазы (23). Активность ЛДГ возрастала только при высоких дозах агента (преимущественно МоО₃ НЧ), которые можно отнести к умеренно токсичным по сравнению с другими металлами переменной валентности (24).

На проявление окислительного стресса указывала и динамика активности каталазы (КТ) и супероксиддисмутазы (СОД). Пики показателей для КТ регистрировали при высокой дозе МоО3 НЧ (29 мг/кг) на 7-е и 14-е сут при разнице с контролем соответственно в 9,0 раза (Р < 0,01) и в 7,9 раза (Р < 0,05). Минимальные дозировки в 1-е сут вызывали всплеск активности КТ (разница с контролем в 4,1 раза), к 7-м сут показатели снижались до 1,5-кратной разницы, а к 14-м сут возрастали, но не достигали исходного уровня. По-видимому, в ответ на усиление перекисного окисления липидов и накопления пероксида водорода и других продуктов окислительного стресса активизируется каталаза, которая их метаболизирует и предотвращает накопление в клетках. Однако некоторые авторы считают, что Мо НЧ нетоксичны и способны выступать в качестве антиоксидантов, например проявляя протективный эффект при контакте с перекисными соединениям (H2O2) и ZnO-NPS, что показано для линий клеток аденокарциномы молочной железы человека (MCF-7) и фибросаркомы (HT-1080). Установлено, что Мо НЧ значительно повышали количество глутатиона в линии MCF-7 (в 1,6 раза) и HT-1080 (в 1,3 раза), что сравнимо с эффектом антиоксидантного препарата N-ацетил-цистеина (NAC) (25).

В печени тоже проявились как минимальные микроструктурные из- менения (зернистая дистрофия, гипертрофия гепатоцитов и гиперхромия их ядер) в случае низких доз Мо НЧ и MoO3 НЧ, так и значительные патологические сдвиги (обширные участки гепатоза и очаги некроза) при высо- ких дозах MoO3 НЧ.

Одним из факторов воздействия наночастиц молибдена на животных могли стать антагонистические взаимодействия молибдена с другими микроэлементами (26). Анализ состава печени, мышечных тканей и головного мозга животных на содержание 25 химических элементов выявил достоверные изменения по трем — Mo, Fe и Ca. Так, в печени в I и II группах по Fe отмечали снижение показателя соответственно на 31,1 (Р < 0,01) и 38,9 % (Р < 0,001) в 1-е сут и на 24,0 (Р < 0,01) и 76,1 % (Р < 0,001) — на 7-е сут. Для тканей головного мозга разница составила 48,3 (Р < 0,001), 90,1 (Р < 0,001) и 21,1 (Р < 0,01), 41,5 % (Р < 0,001). Использование MoO 3 НЧ сопровождалось сходными изменениями. По Ca наблюдали достоверный рост накопления в печени только в 1-е сут — на 17,1 % (Р < 0,05) в I группе и на 26,3 % (Р < 0,01) во II группе. Анализ содержания Mo показал такую же динамику (рис.). Пик значений приходился на 1-е сут и прямо зависел от дозы введения Mo с манифестной разницей (136,9 %) для печени. За следующие 7 сут количество Мo в печени снижалось у животных из II группы на 41,55 %, I — на 4,41 % относительно показателя в 1-е сут.

Печень Головной Печень Головной мозг

7-е сут мозг

1-е сут

Динамика накопления молибдена в органах крыс линии Wistar после однократного введения наночастиц Мо в разных дозировках: а — контроль, б — 1 мг/кг, в — 25 мг/кг.

В головном мозге накопление при дозе 1 мг/кг было сопоставимо с таковым у интактных животных. Увеличение дозы до 25 мг/кг приводит к росту содержания Mo на 83,3 % в 1-е сут и его уменьшению на 7-е сут до значений ниже контрольных.

Полученные результаты в целом закономерны. Известно, что молибден — один из эссенциальных микроэлементов и его недостаток сопровождается развитием ряда патологий у человека и животных (27). Между тем в литера- туре описано и токсическое действие молибдена на организм, тесная связь гиперэлементоза по молибдену и развитием астмы (28), развитием альвеолярных и бронхиальных аденом и карцином (29) и пр.

Таким образом, введение наночастиц Mo крысам сопровождается капиллярно-трофической недостаточностью, признаками окислительного стресса (с более явным проявлением в случае наночастиц оксида молибдена). Учитывая сопоставимые дозы агентов, можно считать наночастицы молибдена менее токсичными, чем наноформы его оксида.