Цитотоксичность новых селективных ингибиторов NHE-1 − производных хиназолин-2,4(1H,3H)-диона VMA 21-14 и VMA 21-10

doi:

ORIGINAL ARTICLE doi:

Acknowledgements: The study was carried out as part of the state assignment of the Russian Ministry of Health, registration no. 124021500036-6.

Проблема поиска эффективных методов фармакологической коррекции системного воспалительного ответа и сопутствующего «цитоки-нового шторма» остается одной из приоритетных задач современной экспериментальной медицины. Ключевую роль в патогенезе таких состояний играет гиперактивация иммунокомпетентных клеток, сопровождающаяся нарушением ионного гомеостаза. Важным регулятором внутриклеточного pH и клеточного объема является натрий-водородный обменник 1-го типа (NHE-1), гиперфункция которого ассоциирована с развитием ишемических повреждений, сердечной недостаточности и неконтролируемого воспалительного ответа [1].

Несмотря на наличие ряда известных ингибиторов NHE-1 (амилорид, зонипорид и др.), их клиническое применение ограничено недостаточной селективностью или наличием побочных эффектов, которые проявляются уже в микро-молярном диапазоне концентраций [2]. В связи с этим актуальным является поиск новых альтернативных химических структур, которые обладают низким уровнем цитотоксичности.

Достаточно перспективными скаффолдами в данном случае являются производные хиназо-лина. Гетероциклическая система хиназолин-2,4(1Н,3Н)-диона привлекает внимание благодаря своей конформационной жесткости и наличию нескольких донорно-акцепторных центров, что открывает широкие возможности для прецизионного управления аффинностью к мишени NHE-1 путем направленного введения заместителей в положениях 1, 3, 6 и 8. Это отличает их от классических ацилгуанидиновых ингибиторов, которые часто демонстрируют проблемы с системной гепатотоксичностью [3].

Ранее в ряду синтезированных нами веществ были получены соединения под шифрами VMA 21-14 и VMA 21-10, которые являются производными хиназолин-2,4(1 Н ,3 Н )-диона и проявляют достаточно высокую ингибирующую активность в отношении NHE-1 [(57,80 ± 3,45) и (29,37 ± 4,40) % соответственно, в концентрации 1•10^-8 М] [4, 5]. Обязательным этапом их доклинического изучения считается оценка биологической безопасности на чувствительных клеточных моделях.

В качестве модели для скрининга были выбраны перитонеальные макрофаги, так как особое значение в каскаде системного воспаления отводится именно им как центральным эффекторным клеткам врожденного иммунитета. Именно макрофаги выполняют функцию центральных регуляторов иммунопатогенеза, координируя интенсивность воспалительной реакции посредством секреции широкого спектра про-и противовоспалительных цитокинов.

Известно, что активация данных клеток сопровождается резким изменением внутриклеточного метаболизма и ионного гомеостаза, в частности, за счет интенсификации работы NHE-1 для поддержания оптимального внутриклеточного pH в условиях локального метаболического ацидоза.

Учитывая, что первичные макрофаги крайне чувствительны к изменениям химического микроокружения, они представляют собой оптимальную биологическую модель для исследования цитотоксических свойств. Оценка жизнеспособности перитонеальных макрофагов при воздействии потенциального лекарственного средства позволяет установить границы безопасных концентраций [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Проведение комплексной оценки цитотоксичности и биологической безопасности новых селективных ингибиторов NHE-1 – производных хиназолин-2,4(1 Н ,3 Н )-диона под шифрами VMA 21-14 и VMA 21-10 на модели первичной культуры перитонеальных макрофагов in vitro .

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись новые производные хиназолин-2,4(1Н,3Н)-диона VMA 21-14 (3-[(5-амино-4H-1,2,4-триазол-3-ил)метил]-1-метилхиназолин-2,4(1H,3H)-дион) и VMA 21-10 (1,3-бис[(5-амино-4H-1,2,4-триазол-3-ил)метил] хиназолин-2,4(1H,3H)-дион).   Подтверждение структуры и верификация чистоты полученных соединений проводились с использованием физико-химических методов анализа.

Идентификация осуществлялась методом ЯМР-спектроскопии на ядрах ¹Н и ¹³С (спектрометр Bruker Avance 600 с рабочей частотой 600 МГц для ¹H и 150 МГц для ¹³С) в ДМСО- d 6 с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта. Контроль чистоты образцов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254 с визуализацией результатов под УФ-лампой VL-6.LC (Vilber) при длине волны 254 нм. Температуры плавления измеряли в стеклянных капиллярах с помощью прибора Mel-Temp 3 (Laboratory Devices Inc., США), обеспечивающего точность ±0,5 °C.

Биологическая часть исследования была выполнена в условиях отсутствия и моделирования воспалительного стресса по оценке жизнеспособности клеток. Для приготовления рабочих растворов навески соединений растворяли в ДМСО. Финальное содержание растворителя в инкубационной среде не превышало 0,5 %, что не оказывало влияния на метаболическую активность и морфологию первичной культуры перитонеальных макрофагов.

В качестве препаратов сравнения использовали селективные ингибиторы зонипорид и римепорид, неселективный блокатор амило-рид (Sigma-Aldrich, США), а также глюкокортикостероидный препарат дексаметазон (KRKA, Словения). Работу выполняли на первичной культуре перитонеальных макрофагов (ПМ), полученных от взрослых беспородных мышей в соответствии с методиками [7, 8]. Все манипуляции с животными соответствовали международным правилам гуманного обращения с лабораторными тест-системами.

Выделение и культивирование клеток. Активированные ПМ получали путем внутрибрюшинного введения 3%-го раствора пептона (Ди-аМ, Россия) за 3 суток до лаважа брюшной полости (0,9%-й NaCl, Мосфарм, Россия). Клетки отмывали раствором Хенкса (ПанЭко, Россия)

при 250 g и ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с 10 % сыворотки (Biosera, Франция), 2 мМ L-глутамина и антибиотиками (пенициллин (ПанЭко, Россия) - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл (ПанЭко, Россия). Суспензию ПМ высевали в 96-луночные планшеты (2 • 106 кл/мл). После 2-часовой адгезии и смены среды клетки культивировали 24 ч до формирования монослоя. Жизнеспособность клеток (95–98 %) верифицировали в камере Горяева с использованием трипанового синего.

Анализ цитотоксического действия. Исследуемые соединения и препараты сравнения вносили в концентрации 100 мкМ (экспозиция -72 ч). Отрицательным контролем служили среда с 0,5%-м ДМСО (Татхимфармпрепараты, Россия), а положительным 1%-м Triton X-100 (Sigma, США).

Для оценки цитопротективных свойств соединений в условиях патологии моделировали ЛПС-индуцированный воспалительный стресс. С этой целью в лунки планшета одновременно с исследуемыми субстанциями вносили липополисахарид (ЛПС) Esherichia coli О111:В4 (Sigma, США).

Метаболическую активность клеток оценивали в МТТ-тесте по образованию кристаллов формазана при добавлении 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (Sigma, США). Регистрацию оптической плотности проводили при λ = 565 нм на микропланшет-ном ридере Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия).

Состояние мембран определяли в ЛДГ-тесте спектрофотометрическим методом на микроп-ланшетном ридере Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия) по убыли NADH (λ = 340 нм) в присутствии пирувата (Sigma, США) в отобранном супернатанте [9]. Выбор условий культивирования, временных интервалов экспозиции, параметров регистрации оптической плотности и последующего математического нормирования данных МТТ- и ЛДГ-анализов проводили с учетом ранее валидированных методических подходах по оптимизации in vitro скрининга [10, 11].

Все экспериментальные измерения для каждого исследуемого соединения выполняли в триплетах (три параллельные лунки внутри одного планшета). Полученные значения усредняли, а итоговые результаты выражали как среднее значение между независимыми экспериментальными сериями ± стандартное отклонение.

Расчет относительной жизнеспособности и сохранности мембранного аппарата клеток (в %)

для каждого теста выполняли методом математического нормирования полученных значений оптической плотности. Для исключения фонового шума, обусловленного поглощением света пластиком планшета, компонентами питательной среды и клеточным деструктом, из показателей всех опытных и контрольных лунок вычитали среднеарифметическое значение оптической плотности группы положительного контроля (1%-й раствор Triton X-100), эквивалентной тотальной гибели и полному разрушению клеточного монослоя (0 % жизнеспособности).

В качестве референсного уровня (100 % выживаемости) принимали показатели группы отрицательного контроля (0,5%-й диметилсульфоксид для интактных условий) или патологического контроля (ЛПС для условий воспалительного стресса). Вычисления проводили по формуле:

Жизнеспособность (%) ^ °°^-°D^^ . ЮО %, ^контроль^тритон где ^^оеыт^- среднее значение оптической плотности в лунках с исследуемым соединением или препаратом сравнения;

OD m_PUmoн — среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (1%-й раствор Triton X-100);

OD _KoH_mpo_nb — среднее значение оптической плотности в лунках отрицательного контроля (0,5%-й диметилсульфоксид для интактных условий) или патологического контроля (ЛПС для условий воспалительного стресса), показатели которых принимались за 100 %.

Статистическая обработка. Систематизацию данных осуществляли в MS Excel 2016, статистический анализ - в программе GraphPad Prism 8.0 согласно руководству [12].

Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова - Смирнова [13]. При нормальном распределении использовали дисперсионный анализ (ANOVA) или t -критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Для распределений, отличных от нормального, применяли критерии Краскела - Уоллиса (с пост-тестом Данна) и Манна - Уитни. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Исследования одобрены Локальным этическим комитетом Волгоградского государственного медицинского университета (регистрационный № ИРБ 00005839 ИОРГ 0004900, ОГРП), свидетельство № 2022/097 от 21.01.22 и № 2025/075 от 26.12.2025.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первичным этапом работы стала верификация физико-химических характеристик и индивидуальности синтезированных соединений, структура которых представлена на рисунке. В ходе проведенного синтеза и последующей очистки были получены кристаллические образцы с высокими выходами, что для соединения VMA 21-14 составило 81 %, значение Rf - 0,56 (в 95%-м этаноле), а температура плавления 351–354 °C. Соединение VMA 21-10 характеризовалось выходом 63 %, значением Rf - 0,63 (в 80%-м этаноле) и температурой плавления 314-318 °C.

Рис. Химическая структура соединений VMA 21-14 и VMA 21-10

В ранее проведенных исследованиях [4, 5] была показана достаточно высокая NHE-1-ингибирующая активность исследуемых соединений. Поэтому критически важным этапом доклинической оценки стало изучение их цитотоксических свойств. Для определения безопасности и исключения неспецифического влияния на клетки-мишени соединения тестировали в заведомо высокой концентрации - 100 мкМ, что существенно превышает терапевтически эффективный диапазон.

Оценка жизнеспособности интактных макрофагов. Первичным этапом скрининга стала комплексная оценка влияния синтезированных соединений на жизнеспособность и функциональное состояние культуры интактных перитонеальных макрофагов. Для получения объек- тивных данных о состоянии клеток был использован подход, включающий одновременное проведение ЛДГ- и МТТ-тестов. Лактатдегидроге-назный тест базируется на определении активности цитозольного фермента, выходящего в культуральную среду только при механическом повреждении или лизисе плазматической мембраны, что позволяет определять прямую мем-бранотоксичность. МТТ-тест отражает состояние клеточного дыхания и оценивает метаболическую активность неповрежденных митохондрий по их способности образовывать кристаллы формазана. При анализе влияния на интактную культуру ПМ было установлено, что соединения VMA 21-14 и VMA 21-10 не обладают повреждающим действием на мембранный аппарат и митохондриальную активность (табл. 1).

Таблица 1

Вещество	Сохранность мембран по данным ЛДГ-теста	Метаболическая активность по данным МТТ-теста
Контроль 1 (ДМСО)	93,08 ± 4,15	100 ± 3,45
Контроль 2 (Тритон Х-100)	0 ± 2,05 *	0 ± 2,26 *
Соединение VMA 21-14	95,03 ± 0,87 #	145,82±11,10 * #
Соединение VMA 21-10	104,75 ± 3,00 #	102,22 ± 5,41 #
Амилорид	83,83 ± 13,55 #	85,66 ± 0,44 * #
Римепорид	97,67 ± 1,40 #	157,05 ± 14,29 * #
Зонипорид	61,06 ± 5,58 * # ## $	132,51 ± 9,18 * #
Дексаметазон	103,53 ± 2,62 #	118,31 ± 15,76 #

Примечание. * Статистически значимо по сравнению с контрольной группой с ДМСО для каждого теста; # статистически значимо по сравнению с контрольной группой с Тритон Х-100 для каждого теста; ## статистически значимо по сравнению с соединением VMA 21-14; $ статистически значимо по сравнению с соединением VMA 21-10 U-критерий Манна - Уитни ( p < 0,05) для каждого теста. Показатели группы Контроль 1 (0,5%-й диметилсульфоксид) приняты за 100 % жизнеспособности; показатели группы Контроль 2 (1%-й Triton X-100) приняты за 0 % жизнеспособности (тотальный лизис). Расчет относительных величин проведен с учетом вычитания фонового экранирования группы Контроль 2.

Влияние соединений VMA 21-14 и VMA 21-10 (100 мкМ) на жизнеспособность интактных макрофагов ( M ± m , % от ДМСО-контроля)

По результатам ЛДГ-теста сохранность клеточных мембран составила (95,03 ± 0,87) % для VMA 21-14 и (104,75 ± 3,00) % для VMA 2110, что достоверно не отличалось от контроля (ДМСО) и показателей дексаметазона. В МТТ-тесте для VMA 21-14 зафиксирован уровень метаболической активности (145,82 ± 11,10) %. Поскольку интенсивность восстановления МТТ-реагента напрямую коррелирует с активностью митохондриальных дегидрогеназ, такие данные позволяют выдвинуть гипотезу о стимулирующем влиянии соединения на энергетический статус клетки. Для соединения VMA 21-10 данный показатель составил (102,22 ± 5,41) %. Полученные данные указывают на отсутствие угнетающего влияния обоих веществ на энергетический обмен клеток. В то же время препараты сравнения ами-лорид и зонипорид в аналогичной концентрации вызывали умеренное снижение жизнеспособности (до 85,6 и 61,1 % соответственно).

Оценка жизнеспособности макрофагов в условиях ЛПС-индуцированного воспалительного стресса. Для оценки профиля безопасности в условиях патологии была использована модель макрофагов, стимулированных липополисахаридом (ЛПС).

Данная модель имитирует метаболическую гиперактивацию клеток при воспалении. Установлено, что соединения VMA 21-14 и VMA 2110 сохраняют высокий уровень безопасности и в условиях стрессового воздействия (табл. 2). Для VMA 21-14 показатели выживаемости составили (103,78 ± 4,97) % (ЛДГ) и (117,83 ± 8,94) % (МТТ), а для VMA 21-10 – (106,60 ± 5,19) % (ЛДГ) и (109,30 ± 7,91) % (МТТ) относительно ЛПС-контроля. Тот факт, что данные параметры не демонстрируют достоверного снижения, подтверждает отсутствие цитотоксического синергизма между исследуемым веществом и бактериальным эндотоксином.

Таблица 2

Вещество	Сохранность мембран по данным ЛДГ-теста	Метаболическая активность по данным МТТ-теста
Контроль 1 (ДМСО)	96,28 ± 1,6 #	97,55 ± 0,74 #
Контроль 2 (Тритон Х-100)	0 ± 7,93 *	0 ± 1,15*
ЛПС	100 ± 1,02 #	100 ± 3,71 #
Соединение VМА 21-14	103,78 ± 4,97 #	117,83 ± 8,94 #
Соединение VМА 21-10	106,6 ± 5,19 #	109,3 ± 7, 91 #
Римепорид	104,06 ± 2,41 #	116,60 ± 10,76 #
Зонипорид	100,95 ± 2,33 #	82,34 ± 8,88 #
Дексаметазон	103,42 ± 4,67 #	87,78 ± 2,78 #

Примечание. * Статистически значимо по сравнению с контрольной группой с ДМСО для каждого теста; ^# статистически значимо по сравнению с контрольной группой с Тритон Х-100 для каждого теста; ^## статистически значимо по сравнению с соединением VMA 21-14; ^$ статистически значимо по сравнению с соединением VMA 21-10 U-критерий Манна – Уитни ( p < 0,05) для каждого теста. Показатели группы патологического ЛПС-контроля приняты за 100 % жизнеспособности макрофагов в условиях воспалительного стресса. Расчет относительных величин проведен с учетом вычитания фонового экранирования группы тотального лизиса (1%-й Triton X-100, условно принятого за 0 %).

Влияние соединений VMA 21-14 и VMA 21-10 (100 мкМ) на жизнеспособность

ЛПС-стимулированных макрофагов ( M ± m , % от ЛПС-контроля)

Обсуждая полученные данные, следует отметить, что отсутствие прироста активности ЛДГ в культуральной среде свидетельствует о сохранении структурной целостности клеточных мембран при воздействии высоких концентраций исследуемых соединений. Сохранение и даже умеренная стимуляция митохондриальной активности в МТТ-тесте подтверждает метаболическую инертность соединений в отношении ключевых ферментативных систем клетки.

Важным аспектом является сохранение безопасности исследуемых соединений в условиях ЛПС-индуцированной активации. Отсут- ствие негативного синергизма между исследуемым веществом и бактериальным эндотоксином доказывает, что VMA 21-14 и VMA 21-10 не нарушают адаптивные механизмы макрофагов в условиях воспалительного микроокружения. Таким образом, полученные результаты характеризуют исследуемое производное как соединение с минимальным риском неспецифической токсичности для иммунокомпетентных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенного исследования установлено, что новые производные хиназолин-

2,4(1Н,3Н)-диона под шифрами VMA 21-14 и VMA 21-10 обладают благоприятным профилем цитотоксичности. В концентрации 100 мкМ соединения не оказывают повреждающего влияния на мембранную целостность и энергетический метаболизм перитонеальных макрофагов как в интактном состоянии, так и в условиях ЛПС-индуцированной активации. Анализ полученных данных подтверждает то, что вы- сокая фармакологическая активность исследуемых соединений является следствием высокоспецифичного взаимодействия с NHE-1-мишенью, а не результатом нарушения клеточного гомеостаза. Отсутствие цитотоксичности в микромолярном диапазоне обеспечивает широкий терапевтический потенциал и обосновывает перспективность дальнейших испытаний in vivo.