Дефокусировка и численная фокусировка в интерференционной микроскопии с широким временным спектром поля освещения

Системы интерференционной микроскопии с цифровой записью интерференционных сигналов предоставляют возможность численной фокусировки, т.е. получения резких изображений расфокусированных объектов путем специальной численной обработки сигнала [1–17]. Численная фокусировка на основе различных подходов используется в различных методах интерференционной микроскопии, таких как цифровая голографическая микроскопия (ЦГМ) [1– 4], оптическая когерентная томография/микроскопия (ОКТ/ОКМ) [5–16], дифракционная фазовая микроскопия (ДФМ) [17].

Одним из основных параметров в алгоритмах численной фокусировки является длина волны или временная частота волнового поля. Однако некоторые системы интерференционной микроскопии используют освещение с широким спектром временных частот (временным спектром) для селекции сигнала по глубине (ОКТ/ОКМ во временной области [6, 18, 19]) или снижения когерентных шумов (например, ДФМ [20, 21]). В этих системах численная фокусировка может быть использована для различных задач. Например, в ОКТ / ОКМ во временной области численная фокусировка может быть использована для решения проблемы расхождения положения окна временной когерентности и положения фокуса при визуализации внутренней структуры объекта, показатель преломления которого отличается от показателя преломления иммерсии [6].

В системах ОКТ / ОКМ в фурье-области записывается множество квазимонохроматических сигналов с различными центральными частотами. Это позволяет проводить численную фокусировку раздельно для каждого квазимонохроматического сигнала, комбинируя их после этого в результирующий сигнал с ши- роким временным спектром, обладающий свойством продольной селекции [11, 14–16]. Однако такой подход требует большого объема вычислений для получения каждого трехмерного изображения. Для увеличения скорости вычислений могут быть использованы различные методы [8–10,12–14, 16]. Значительного увеличения скорости вычислений можно добиться путем инверсии порядка этих операций: получить низкокогерентный сигнал с широким временным спектром на множестве глубин (путем фурье-преобразования массива данных по частоте), а затем к этому сигналу применить алгоритм численной фокусировки [12, 13].

Данная работа посвящена анализу влияния освещения с широким временным спектром на свойства расфокусированного интерференционного сигнала и численно сфокусированной визуализации в интерференционной микроскопии. В параграфе 1 проведен теоретический анализ формирования сигнала когерентности в интерференционном микроскопе с пространственно когерентным освещением объекта плоской волной с широким временным спектром, распространяющейся вдоль оптической оси (под сигналом когерентности понимается часть полного сигнала интерференционного микроскопа, соответствующая функции взаимной когерентности объектного и опорного полей). В параграфах 2 и 3 показано, что отличия во влиянии дефокусировки на различные спектральные компоненты сигнала с широким временным спектром могут приводить к ухудшению изображений расфокусированных частей объекта, несмотря на использование численной фокусировки. Величина этих эффектов зависит от различных параметров, таких как ширина временного спектра сигнала когерентности, величина числовой апертуры изображающей системы и величина дефокусировки.

1. Формирование сигнала когерентности с широким временным спектром

Рассмотрим изображающую часть системы интерференционного микроскопа, представленную на рис. 1.

Рис. 1. Анализируемая часть системы интерференционного микроскопа

В случае схемы на отражение объект освещается плоской волной со стороны микрообъектива, что может быть достигнуто путем фокусировки освещающего поля в задний фокус микрообъектива MOS (как, например, в [9, 12-14]). Отраженное от объекта поле проходит через микрообъектив MOs с задним фокусным расстоянием f ′, тубусную линзу ТЛ с задним фокусным расстоянием f' и падает на матричный фото детектор МФ (nim - показатель преломления иммерсии, f - переднее фокусное расстояние микрообъектива, zs -расстояние между поверхностью объекта и передней главной плоскостью микрообъектива, L - расстояние между задней фокальной плоскостью микрообъектива (в которой также находится его выходной зрачок) и передней главной плоскостью тубусной линзы).

Рассмотрим компоненту отраженного от объекта поля с круговой временной частотой го, соответ- ствующую отражению от границы раздела с поперечной структурой амплитудного коэффициента отражения rs(го; xs, ys), расположенной под N пло-скопараллельными слоями объекта с толщинами {AZj} и показателями преломления {nj}. Обозначим комплексную амплитуду поля, формируемого непосредственно после отражения от этой границы, через VS2. Комплексную амплитуду плоской вол- ны, падающей на границу раздела rS, обозначим через Vо(го)Bs(го), где Vо(го) соответствует комплексной амплитуде поля освещения в некоторой точке до разделения пучков на объектный и опорный (или после разделения при условии идентичности объектного и опорного полей), а Bs(го) определяется амплитудно-фазовыми изменениями V0 при распространении до границы rs. Тогда

^VS 2^{( ro} ; ^xs , y s ) = V 0 ^{( to} ) B s ^{( to )} r s ^{( to} ; X s , y s )• ⁽¹⁾

Связь комплексной амплитуды «эффективного» поля в передней фокальной плоскости микрообъектива V f с V ^₂ можно описать в соответствии с [22, 23]

следующим образом:

Т /      7     7 X             /      7     7 X

V f ^{( го} ; kx . k y ) = V s 2 ^{( го} ; kx , k y )

N

П t j , j —i ^{( ro} ; k x , k y )

. j =1

x exp

i f A z Jk - n j - k x - k y . j = ⁰

×

где k = го/ c , n о = n im , A z о = z s - f |, j -i - амплитудный коэффициент пропускания границы раздела j и j -1 слоев, тильда обозначает поперечный пространственный спектр соответствующей функции.

Опорное поле может быть сформировано различными способами, для общности запишем выражение для его комплексной амплитуды в следующем виде:

^Vr ( ю ; x , y ) = V o ⁽ to ) Br ( to ; x , y ), ⁽³⁾ где функция B r (го; x, y ) определяется амплитуднофазовыми изменениями V 0 при распространении в опорном плече до плоскости регистрации.

Выражения для спектральной плотности освещающего поля I о и взаимной спектральной плотности объектного и опорного полей в плоскости регистрации Г могут быть записаны в виде [23]

V V С ® ) V o* ( «0) = 2 n5 ( to- to’ ) I о ( to ) , (4)

VV_s ( to ; x , y)V * ( to' ; x , y )^ = 2 п5 ( го-го' ) Г ( го ; x , y ). (5)

Используя выражения (1)-(5), а также выражение для связи комплексной амплитуды объектного поля в плоскости регистрации V s ( to ; x , y ) с комплексной амплитудой «эффективного» поля V из [22, 24], получим следующее выражение для взаимной спектральной плотности Г:

r ( to ; x , y ) = I о ( to ) B'_s ( to ) B R ( to ; x , y ) ц , ( to ; x , y ) x ^x ( f / ^k ) ² JJ r s ^{( to} ; ^- Mk x , ^{- Mk}y ) ^x

N x Пtj,j-1

j =1

( to ; - Mk x , — Mk y )

N exp[ i f Azj x j=0

том продольной селекции сигнала (по глубине) окном временной когерентности (или, в немного другой терминологии, окном временного спектра [24]). Будем считать, что интерференционный микроскоп отъюстирован таким образом, что положение окна временной когерентности совпадает с плоскостью визуализируемой структуры в объекте, т.е.

B'_s ( to ) B R ( to ; 0,0) ц i ( to ;0,0) exp

= B S ( to ) B R ( to ; 0,0) ц i ( to ; 0,0)|.

N ik ^ nj Azj j=0

Отметим, что в ОКТ/ОКМ в фурье-области записывается множество квазимонохроматических сигналов с различными центральными частотами, каждый из которых можно приближенно (пренебрегая шириной спектра отдельного сигнала) считать пропорциональным Г( ю ; x , y ) с соответствующей величиной и. Это позволяет проводить численную обработку каждого из таких сигналов по отдельности - до комбинации в результирующий сигнал с широким временным спектром. Поэтому в случае ОКТ/ОКМ в фурье-области и устранение поперечной структуры в B R ( to ; x , y ) ц i ( to ; x , y ), и смещение положения окна временной когерентности на нужную глубину может быть произведено численно, без дополнительной юстировки оптической схемы.

Соответствующий сигнал взаимной спектральной плотности можно записать в следующем виде:

r‘ ( to ; x , y ) = 1 0г ( to )( M /(2 n )²) x

Отметим, что выражения, аналогичные (8)-(10), можно получить при рассмотрении схемы на пропускание с плоской волной освещения, падающей слева на объект на рис. 1. В этом случае вместо амплитудного коэффициента отражения визуализируемой границы r s ( to ; x s , y s ) необходимо подставить ее амплитудный коэффициент пропускания t s ( to ; x s , y s ).

Кроме того, сходные выражения можно получить и в случае ДФМ с пространственно когерентным освещением (или с очень малой числовой апертурой освещения [21]) (с точностью до некоторых отличий, таких как дополнительный переворот и дополнительное увеличение изображения в дифракционном фазовом модуле). В ДФМ условие (7) выполняется в силу самой конструкции схемы.

x JJ / S ( to ; - Mk x , - Mk y )

N

П t jj -M ^- Mk x , ^- Mk y )

j =1

×

N

x exp i ^ A z j .( jlk

_ j =0       '

2 nj- M 2( kx + ky2) - knj)

×

× A

k ।

^to ; ^- f —,^- f — I ^exp^[ i ^{( k}x x + ^ky y ^)] d ^kx d ^ky , k k j

1 0г ( to ) = 1 0 ( to) | B S ( to ) B R ( to ; 0,0)| n ( to ),

П(и) - спектральная чувствительность фотодетектора.

Полный сигнал когерентности, получаемый при использовании освещения с широким временным спектром или в результате численной комбинации множества квазимонохроматических сигналов (как в ОКТ/ОКМ в фурье-области), представляет собой массив отсчетов, пропорциональных [23, 24]

∞

Г ⁽ t ) ( x , y ) = — [r' ( to ; x , y ) d to . ^{2 n} 0

В случае ОКТ/ОКМ в фурье-области вместо интеграла в (10) следовало бы записать сумму конечного количества отсчетов Г ‘, однако, поскольку в рамках данной работы эффекты дискретизации не представляют первоочередного интереса, для простоты анализа здесь и далее используются непрерывные преобразования.

2. Влияние дефокусировки на сигнал когерентности с широким временным спектром

Рассмотрим пространственный спектр сигнала когерентности Г ⁽ * ) ( x , y ):

^{Г (} t ) ^{( k}x , ^ky ) = JJ ^r ( ' ) ^{( x} , y ) ^exP^{[ -} i ^{( k}x x ^{+ k}y y ^)] dxdy . ⁽¹¹⁾

Для анализа дефокусировки и численной фокусировки представим Г ⁽ ‘ ) ( k_x , k y ) в виде произведения поперечного пространственного спектра визуализируемой структуры на некоторый множитель (т.е. предположим инвариантность импульсного отклика в поперечном направлении в пределах рассматриваемой части поля зрения). Для этого используем следующее приближение:

^rs ^{( to} ; ^xs , y s ) = ^rs to ^{( to )} r s ^{( x}s , y s )                       ⁽¹²⁾

(условие (12) должно выполняться только в пределах ненулевых значений 1 0r ( to )). Получим

г ⁽ t ) ( k x , k y ) - r s ( - Mk x , - Mk y ) 5 _B ( k x , k y ),          (13)

⁵ B ^{( k}x , ^ky ) = M j I ‘ г ^{( to )} A | ^to ; ^- f ’ ^kf- , ^{- f} ’ ^kf |^x 2 n ^J₀         ( k k j

×

N n tj,j-1(to;-Mkx,-Mky)

. j =1

x exp i ^ Azj(

_ j =0       ^v

N

^{2 n}j ^{- M 2( k}x ^{+ k}y) ^{- kn}j )

I or ^{( to )} I 0Г ^{( to ) r}s to ^{( to )} .

d to ,

Функция 5 b ( k x , k y ) определяет пространственный спектр импульсного отклика (функции рассеяния точки (ФРТ)) в поперечном направлении сигнала когерентности. Как видно из выражения (14), при равенстве нулю величины k _± = ( k x + k y )^1/2 экспонента в

подынтегральном выражении в (14) обращается в единицу. При увеличении k ₁ эта экспонента создает фазовую модуляцию по и, что может привести к уменьшению величины интеграла по и, т.е. ослаблению высоких поперечных пространственных частот с дефокусировкой и, соответственно, снижению поперечного разрешения. Эта фазовая модуляция по и для

к ₁ > 0 может быть частично скомпенсирована изменением разности хода плеч, соответствующим положению окна временного спектра, отличающемуся от определяемого выражением (7) (частично, т.к. эта фазовая модуляция не является линейной по го). Это означает, что в системах ОКТ/ОКМ высокие поперечные пространственные частоты не пропадают в дефокусированном сигнале полностью - искажается положение соответствующих компонент сигнала в получаемом трехмерном изображении в продольном направлении (по глубине).

Для проведения численной фокусировки для центральной временной частоты необходимо умножить Г(t) (kx, ky) на фазовый множитель exp

N

• ^- i Е ^A j (V ^k 0 n 2 — ^{M 2}( k ² + k ²) — ^k 0 n . j =0        ^x

  
  

где к о = го о / c , го о - центральная частота для I 0 _Г ( го ), а затем выполнить двумерное преобразование Фурье полученной функции (точнее, полученного массива). Соответствующий пространственный спектр запишется в виде, аналогичном (13), где вместо S в ( k x , k y ) необходимо записать

⁵ Bnf ^{( k}x , ^ky ) = M J I Or ^{( го )} A |^ro ; ^- f_L ^ , ^{- f} ‘ ^k y- 1^x 2 n 0        ( k k )

×

N

П t j , j -i ^{( ro} ; ^{- Mk}x . ^{- Mk}> )

. j =1

x exp

N iV Az, Jk2n2 - M2 (k,2 + kv2) - kn.

j j      xy j j=0      '

^-^ ^k 0 n ^{2 -} M ²( ^kX + ^k 2 ⁾ + ^k 0 n j )

d to.

Из выражения (17) видно, что коррекция фазовой модуляции в подынтегральном выражении произошла только для центральной частоты го 0 ; для других частот го может наблюдаться остаточная фазовая модуляция по ( k x , k y ), которая также может приводить к снижению поперечного разрешения в сигнале когерентности.

3. Численное моделирование сигнала когерентности с широким временным спектром

Для более подробного анализа влияния ширины временного спектра освещения (точнее, ширины функции 10Г (го), определяемой помимо спектра освещения свойствами оптических элементов, спектральной чувствительностью фотодетектора и свойствами визуализируемого объекта) было проведено численное моделирование, результаты которого представлены на рис. 2 - 7. Для моделирования использовалась прямоугольная функция 10Г (го) с параметрами, соответствующими центральной длине волны Х0 = 850 нм и ширине в шкале длин волн АХ = 40 нм (рис. 2а, 3а, 4а и 5а) и АХ =100 нм (рис. 2б, 3б, 4б, 5б, 6а, 6б и 7). Числовая апертура микрообъек тива АА = 0,4, в качестве апертурной функции A(го; x0,у0) рассматривалась функция-круг (относительно (x0,у0)), не зависящая от го. Анализировалась визуализация структуры, расположенной под одним слоем объекта толщиной Az 1 с показателем преломления n1 = 1,33; поверхность объекта расположена в передней фокальной плоскости микрообъектива (т.е. Az0 = 0). Зависимость 11,0 от (го; kx, ky) не учитывалась.

На рис. 2 представлены зависимости модуля функции Е B от нормированной поперечной пространственной частоты, определенной аналогично [16], k ' = Mk _± / k ₀ . На рис. 3 представлены аналогичные зависимости для аргумента функции Е Bnf . На рис. 4 и 5 представлены зависимости модуля импульсного отклика в поперечном направлении, масштабированного к пространству предметов, от р S = ( x 2 + у² )^1/2 при численной фокусировке в соответствии с выражениями (16) и (17) в двух вариантах нормировки.

Рис. 2. Зависимость модуля Ξ B от нормированной поперечной пространственной частоты

Рис. 3. Зависимость аргумента Ξ Bnf от нормированной поперечной пространственной частоты

На всех рис. 2 - 7 сплошная линия соответствует A z 1 = 0 (т.е. отсутствию дефокусировки), пунктирная линия: A z 1 = 70 мкм, штриховая линия: A z 1 = 140 мкм, штрихпунктирная линия: A z 1 = 210 мкм.

Рис. 4. Форма импульсного отклика в поперечном направлении, масштабированного к пространству предметов (нормировка на единичный максимум при ∆ z 1 = 0)

а)

• б)

Рис. 5. Форма импульсного отклика в поперечном направлении, масштабированного к пространству предметов (нормировка на единичный максимум для каждой величины ∆ z 1 )

Как видно из рис. 2, отличие фазовых модуляций пространственного спектра компонент с различной временной частотой может приводить к ослаблению пространственного спектра результирующего сигнала с широким временным спектром на высоких пространственных частотах. С увеличением диапазона детектируемых поперечных пространственных частот (а значит, с увеличением числовой апертуры используемого микрообъектива) значение этого эффекта возрастает. Кроме того, как видно из рис. 3, численная фокусировка на основе коррекции фазы для центральной временной частоты может не приводить к полной коррекции фазовой модуляции поперечного пространственного спектра в случае использования широкого временного спектра.

Эти эффекты ведут к ослаблению сигнала (рис. 4) и расширению импульсного отклика в поперечном направлении, т.е. снижению поперечного разрешения (рис. 5).

Для более эффективной численной фокусировки такого сигнала возможно использование подхода с полной коррекцией фазовой модуляции ΞB, по аналогии с [15, 16, 25]. Для этого необходимо умножить пространственный спектр сигнала Г(t)(kx, ky) на функцию коррекции

[ ^ B ( kx , ^ky )

* B ( kx , k y ) = ^S B ^{( k}x , ^ky )|

, если

0, если

IS B ( k x , k y )| >  0, 13 B ( k x , ky )| = 0,

и выполнить двумерное преобразование Фурье полученной функции (массива).

Рис. 6. Форма импульсного отклика в поперечном направлении, масштабированного к пространству предметов, при использовании численной фокусировки (18)

На рис. 6 приведены графики, иллюстрирующие использование такого подхода к численной фокусировке (Δλ = 100 нм). Рис. 6 а соответствует нормировке на единичный максимум при Δ z 1 =0, а рис. 6 б – нормировке на единичный максимум для каждого Δ z 1 . Как видно из рис. 6, данный подход к численной фокусировке сигнала может быть более эффективным, однако не приводит к полной коррекции сигнала.

Результаты моделирования, представленные на рис. 2 –6, соответствуют равенству оптических длин объектного и опорного плеч в соответствии с равенством (7). В ДФМ это соотношение определяется конструкцией схемы и не изменяется в процессе визуализации. В системах ОКТ / ОКМ, использующих сканирование разности хода (механическое или численное), эти эффекты приобретают более сложный характер. Как было отмечено выше, в случае дефокусировки положение окна временного спектра, соответствующее равенству (7), может не быть оптимальным для высоких поперечных пространственных частот. Рассмотрим случай немного отличающегося положения окна временного спектра путем внесения в подынтегральное выражение в (14) дополнительного множителя exp [- ik 2 n i N z i ] (в ОКТ/ОКМ это соответствует изменению глубины анализа сигнала в среде с показателем преломления n 1 на N z i ). Соответствующие распределения модуля Ξ B при Δλ = 100 нм представлены на рис. 7.

1 0,8 1^1 °’⁶ 0,4 0,2 О

О 0,1     0,2     0,3     0,4    £1

Рис. 7. Зависимость модуля Ξ B от нормированной поперечной пространственной частоты при смещении окна временного спектра ( Δ z l = 2,7 мкм)

Как видно из рис. 2 и 7, с точки зрения ОКТ/ОКМ дефокусировка привела не столько к исчезновению компонент сигнала, соответствующих высоким поперечным пространственным частотам, сколько к смещению соответствующего им сигнала по глубине, т.е. специфическому размытию сигнала в продольном направлении. При трехмерной визуализации объектов в ОКТ/ОКМ это может приводить к смешению высоких поперечных пространственных частот с одной глубины объекта и низких – с другой.

Отметим, что этот эффект размытия сигнала связан именно с дефокусировкой. В ОКТ/ОКМ эффекты дефокусировки связаны с изменением оптической разности хода и могут проявляться наряду с эффектами дисперсии, которые в данной работе не рассматривались.

Заключение

В данной работе проведен теоретический анализ влияния освещения с широким временным спектром на свойства расфокусированного интерференционного сигнала и численно сфокусированной визуализации в интерференционной микроскопии. Показано, что при слишком большой ширине временного спектра и значительной дефокусировке отличия в изменении различных спектральных компонент сигнала при дефокусировке могут приводить к ухудшению изображений расфокусированных частей объекта, несмотря на использование численной фокусировки. Например, как видно из рис. 2 и 3, при NA = 0,4, λ 0 = 850 нм и ширине временного спектра Δλ =40 нм искажение поперечного пространственного спектра сигнала когерентности осталось небольшим при всех рассмотренных величинах дефокусировки. При Δλ = 100 нм существенное искажение поперечного пространственного спектра произошло уже при величине дефокусировки Δ z 1 = 140 мкм. Чем выше числовая апертура микрообъектива, тем меньше величина дефокусировки, при которой начинают проявляться эти эффекты.

При равенстве оптических длин объектного и опорного плеч в соответствии с (7) использование освещения с широким временным спектром может приводить к ослаблению высоких поперечных пространственных частот в сигнале когерентности от расфокусированных объектов и снижению поперечного разрешения. Этот эффект может проявляться, например, в системах ДФМ с микрообъективами с большими числовыми апертурами и ши- роким временным спектром освещения, такими как в [21].

Этот эффект также можно рассматривать в качестве одного из механизмов снижения когерентных шумов при использовании освещения с широким временным спектром. Наличие частиц пыли или микроцарапин на оптических элементах приводит к появлению паразитных дифракционных картин в формируемых изображениях. Однако, если эти частицы удалены от положения фокуса (т.е. предметной плоскости), высокие поперечные пространственные частоты в соответствующих дифракционных картинах могут быть ослаблены за счет использования освещения с широким временным спектром.

При отклонении от равенства оптических длин объектного и опорного плеч использование широкого временного спектра может, наоборот, приводить к сохранению высоких поперечных пространственных частот при ослаблении низких (рис. 7). При трехмерной визуализации объектов в системах ОКТ / ОКМ это может приводить к смешению в получаемом 3D-изображении высоких поперечных пространственных частот с одной глубины объекта и низких – с другой, т.е. к ухудшению продольного разрешения.

В этом случае предпочтительным с точки зрения сочетания качества изображения и скорости обработки сигнала в ОКТ / ОКМ в фурье-области может быть комбинированный подход к обработке сигнала:

• 1)    получение трехмерного сигнала с численной фокусировкой в C-режиме аналогично [10, 14];

• 2)    дополнительная численная фокусировка полученного на первом шаге сигнала с широким временным спектром.

Иными словами, в этом случае индивидуальная коррекция дефокусировки для каждой спектральной компоненты производится лишь на первом этапе процедуры, т.е. для небольшого количества глубин. Для большей части глубин результирующего 3D-изображения численная фокусировка производится уже после применения фурье-преобразования по временной частоте, т.е. для сигнала с широким временным спектром. При этом отклонение от положений численных фокусов первого этапа процедуры оказывается достаточно небольшим. Отметим, что эффекты дисперсии также могут быть скорректированы в процессе обработки с численной фокусировкой в С-режиме для выбранных глубин.

В данной работе был проведен анализ свойств сигнала в интерференционных микроскопах с освещением объекта плоской волной, распространяющейся вдоль оптической оси. Сделанные выводы также справедливы для некоторых систем ЦГМ и ОКТ / ОКМ с пространственно частично когерентным освещением [16, 25] при малых числовых апертурах освещения NA i (в силу сходства соответствующих сигналов при NA i →0). В случае других типов освещения влияние широкого временного спектра освещения на свойства сигнала когерентности требует специального исследования.

Исследования выполнены за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-19-10528).