Действие амарантина на стрессоустойчивость томатов (Lycopersicon esculentum Mill.), инвазированных галловой нематодой (Meloidogyne incognita)

Согласно современным представлениям, фитопатогены — это факторы стресса, которые вызывают комплексные защитные реакции растений, включающие как неспецифические (общие для разных типов стрессоров), так и специфические компоненты (1). Вместе с тем биогенный стресс, индуцированный фитопатогенами, имеет ряд особенностей, отли- чающих его от стресса, вызванного абиогенными экстремальными факторами. Это в полной мере относится и к фитопаразитическим нематодам, которые оказывают на растения многофакторное воздействие физической и химической природы (2).

Нематоды, особенно седентарные, к которым относятся галловые нематоды Meloidogyne , — опасные паразиты сельскохозяйственных растений, наносящие ущерб свыше 80 млрд евро в год (3). При инвазии растений нематодами возникают симптомы, характерные для эффектов таких экстремальных факторов, как засуха, холод, минеральное голодание. Заражение нематодами влияет на дыхательный газообмен, приводит к снижению фотосинтеза, появлению в тканях высокореактивных радикалов кислорода с образованием токсичных промежуточных продуктов, вызывающих окислительный стресс (4 - 6)

Среди факторов, способствующих выживанию растений при биогенном стрессе, в том числе обусловленном поражением фитопаразитиче-скими нематодами, важную роль отводят веществам специализированного обмена. Они могут действовать на патоген как токсины, влиять на ростовые, линочные процессы и вылупление личинок; известно, что эти метаболиты обладают антифидантными и адаптогенными свойствами, изменяют состояние внутриклеточных мембран, нормализуют процессы фотосинтеза и интенсивность общего обмена у зараженных растений (7-10).

Амарант относится к числу сельскохозяйственных культур, для которых характерен богатый состав низкомолекулярных метаболитов, проявляющих защитное и иммуностимулирующее действие на живой организм (11, 12). Высокое содержание детеррентов, в том числе алкалоида амаран-тина, делает амарант малопривлекательным для многих фитопатогенов (13). Данные о поражаемости растений амаранта фитонематодами малочисленны и противоречивы. При испытании 10 видов амаранта на устойчивость к галловым нематодам в условиях Южной Африки не было выявлено образцов, устойчивых к Meloidogyne incognita раса 2 и Meloidogyne javanica (14). Однако имеются данные, указывающие на высокую степень устойчивости гибридов амаранта к галловой нематоде (15). Следует отметить положительный результат, полученный при введении растений амаранта в севооборот для борьбы с галловой нематодой M. javanica на пасленовых и тыквенных культурах (16). Противоречивость данных, по-види-мому, связана с большим разнообразием видоспецифических свойств, включая состав и содержание вторичных метаболитов растений этого рода, насчитывающего до 90 видов.

Среди метаболитов красноокрашенных растений амаранта Amaran-thus tricolor L., снижающих последствия окислительного стресса в растительном организме, выделяют фиолетово-красный бета-цианиновый пигмент амарантин. Показана способность амарантина обезвреживать супе-роксид-анионы (O₂ ^{• -} ), свободные радикалы и хелатировать ионы двухвалентного железа (17). Экзогенно введенный амарантин увеличивает перенос электронов по нециклическому пути (реакция Хилла) в изолированных хлоропластах (18). Обнаружена способность амарантина участвовать в защитно-приспособительных реакциях в ответ на фотостресс, стимулировать рост растений и прорастание семян, а также положительный эффект при воздействии экстремальных температур и засухи (12). Амарантин проявлял защитное действие при обработке листьев огурца, пораженных сокососущим насекомым трипсом (13).

Высокая биологическая активность амарантина, выделенного из A. tricolor , в сочетании с антиоксидантными и антифидантными свойства-98

ми делают его перспективным фактором стрессоустойчивости растений при инвазии паразитическими нематодами.

В настоящей работе впервые показано адаптогенное действие ама-рантина при нематодной инвазии у растений томата, что выражается в активации энергетического обмена и восстановительных процессов.

Наше целью была оценка влияния амарантина на морфофизиологические и фотосинтетические характеристики растений томата при заражении галловой нематодой Meloidogyne incognita , а также изучение морфофизиологических показателей у нематод из растений, обработанных ама-рантином.

Методика. Исследования проводили в 2016-2017 годах на растениях томатов ( Lycopersicon esculentum Mill.) гетерозисного гибрида F₁ Карлсон со степенью устойчивости 30 % к Meloidogyne incognita ( Kofoid & White, 1919) Chitwood 1949. Амарантин выделяли из свежесобранных листьев амаранта ( A. tricolor L.) сорта Валентина селекции Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур (авторы В.К. Гинс, П.Ф. Ко-нонков, М.С. Гинс) (12). В опытах использовали лиофильно высушенный порошок амарантина.

О влиянии амарантина на жизнеспособность нематод судили по двигательной активности личинок II возраста в водных растворах (2,0; 1,0; 0,75; 0,5 мг/мл) в опытах in vitro. Контролем служили нематоды, помещенные в дистиллированную воду. Повторность опыта 3-кратная для каждого варианта (по 20 личинок) . В эксперименте использовалась галловая нематода, культивируемая в лабораторных условиях на корнях восприимчивого сорта томата (первоисточником служил материал из совхоза «Тепличный», г. Москва). Личинок M. incognita получали из выделенных яйцевых мешков нематод, обитающих в корнях зараженных растений томата (19). Подвижность особей оценивали через 24 и 48 ч. Личинок инкубировали в термостате во влажной камере при 25 ° С.

Также in vitro определяли действие различных концентраций ама-рантина (1,0; 0,5 и 0,1 мг/мл) на прорастание семян томата, для чего их замачивали в водных растворах вещества в течение 3 ч. В качестве контроля использовали семена, замоченные в дистиллированной воде. В каждом варианте было по 20 семян. Проращивание осуществляли во влажной камере при 25 ° С. Развитие проростков оценивали через 3, 5 и 7 сут.

Влияние амарантина на томаты и галловую нематоду исследовали в условиях лабораторной теплицы. Перед посадкой семена замачивали в растворах амарантина (0,5 и 1,0 мг/мл) в течение 3 ч. Рассаду в фазу 3-4 настоящих листьев опрыскивали растворами амарантина в тех же концентрациях и одновременно заражали нематодой (3 тыс. личинок/растение). Контролем служили здоровые и зараженные растения, обработанные водой. Растения выращивали в отдельных вазонах объемом 1 л (по 10 шт. в варианте). Эффективность воздействия амарантина оценивали на 40-е сут после инвазии корней нематодами. Учитывали степень зараженности корня по 5-балльной шкале (1-10 % — 1 балл; 11-35 % — 2 балла; 36-70 % — 3 балла; 71-100 % — 4 балла), наличие сингаллов (число галлов/г корня), массу надземной части и корней, а также морфофизиологические показатели, служащие индикаторами состояния популяции паразита: размеры самок и их плодовитость (число яиц в оотеке) (20).

Содержание хлорофиллов и каротиноидов оценивали по спектрам поглощения этанольных экстрактов листьев (21) на 10-е и 40-е сут после инвазии растений галловой нематодой и некорневой обработки зараженных растений водным раствором амарантина в концентрации 0,5 мг/мл

(спектрофотометр Solar PB2201, ЗАО «СОЛАР», Белоруссия).

Для выделения хлоропластов 1 г листьев растирали в среде следующего состава: 0,3 M сахароза; 0,1 M NaCl; 0,01 M MgCl₂; 0,05 M трисбуфер; 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) (pH 7,5). Профильтрованный через полотно гомогенат осветляли 3 мин при 250 g (центрифуга MPW 251, «MPW Med. Instruments», Польша), осаждая неразрушенные клетки и их крупные фрагменты. Повторное центрифугирование надосадочной жидкости проводили при 1000 g в течение 10 мин. Осадок хлоропластов суспендировали в среде следующего состава: 0,3 M сахароза; 0,025 M NaCl; 0,01 M MgCl 2 ; 0,05 M трис-буфер (pH 7,5).

Потенциальную способность электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) осуществлять перенос электронов воды на феррицианид калия или молекулярный кислород оценивали в условиях раздельного функционирования каждого из этих акцепторов по скорости восстановления O2. Фотовосстановление O2 определяли по его поглощению с реагентом реакции Меллера (адреналином), обладающим способностью взаимодействовать с супероксидным анион-радикалом на восстановительном участке фотосистемы. В реакционную среду вносили адреналин (0,3 мМ) (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) или феррицианид калия (0,5 мМ). Концентрацию кислорода определяли амперометрически на полярографе Universal polarograf OH-105 («Radelkis», Венгрия) в ячейке объемом 1,2 мл с закрытым платиновым электродом, pH реакционной среды 7,8. Суспензию хлоропластов освещали белым светом (осветитель ЛЭТИ-60, ОАО «Казанский оптико-механический завод», Россия). Концентрацию хлорофилла рассчитывали по формуле Арнона.

Данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа (ANO-VA) в программе STATISTICA 6.0 («StatSoft, Inc.», США). В таблицах приведены средние значения ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM). Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты. Обработка семян амарантином в концентрациях 1,0 и 0,5 мг/мл стимулировала прорастание. Семена в опыте проросли на 2-3 сут раньше контрольных. На 5-е и 7-е сут средняя длина корешка у проростков, обработанных амарантином (1,0 мг/мл), превышала показатель в контроле на 10 и 18 % (р ≤ 0,05) (табл. 1), в этом варианте также раньше образовывались и развернулись семядольные листья.

1. Всхожесть и развитие корешков у проростков томата ( Lycopersicon escu-lentum Mill.) гетерозисного гибрида F₁ Карлсон при обработке семян раствором амарантина в разной концентрации ( n = 20, in vitro)

Вариант	Время после замачивания
	3-и сут	5-е сут		7-е сут
	проросло семян, %	проросло семян, %	длина корешка, см ( M ±SEM)	проросло семян, %	длина корешка, см ( M ±SEM)
0,1 мг/мл                   0              40         0,95±0,220          100          3,34±0,510 0,5 мг/мл                    0               50          1,22±0,280           100           2,86±0,090 1,0 мг/мл                   40              60          1,55±0,430           100          3,49±0,280* Контроль (вода)            0              40          1,40±0,470          100          2,96±0,460 * Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Также было выявлено нематостатическое действие амарантина в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/мл (табл. 2). Личинки в этих растворах теряли подвижность, но восстанавливали ее после выдерживания в дистиллированной воде. В 1,0 мг/мл растворе амарантина утрата подвижности нематод наступала через 24 ч. Выдерживание нематод в 0,5 мг/мл водном растворе в течение 48 ч приводило к потере подвижности ∼ 50 % личинок.

Летальной для личинок была концентрация амарантина 2 мг/мл.

Аналогичные свойства ранее были отмечены у алкалоида физостигмина со схожей с амарантином структурой. Это соединение, выделенное из Calabar bean (сем. Fabaceae ), в концентрации 1,0 мг/мл обладало нематостатическим действием на мигрирующую нематоду Ditylenchus dipsaci . Предобработка проростков гороха раствором сульфата физостигмина (0,03 мг/мл) в значительной мере предохраняла растения от заражения нематодой. Возможно, что механизм действия амарантина на нематод аналогичен действию физостигмина (22).

2. Число подвижных личинок галловой нематоды ( Meloidogyne incognita ) II возраста в растворах амарантина разной концентрации ( M ±SEM)

Вариант	Время после обработки, ч	В конце эксперимента
	0         1       24              48	после помещения в воду

0,5 мг/мл	20±0,6	20±0,6	11±1,8	19±0,6
0,75 мг/мл	20±1,2	18±3,0	9±3,6	17±3,0
1,0 мг/мл	20	2±1,2	0	15±4,1
2,0 мг/мл	20	0	0	2±1,2
Контроль (вода)	20	20	19±0,6	19±0,6

Внекорневая обработка вегетирующих растений водными растворами амарантина в концентрации 0,5 и 1,0 мг/мл приводила к снижению численности паразитирующих на корнях нематод, а также влияла на их морфофизиологические характеристики. На растениях, обработанных растворами амарантина, число половозрелых самок в расчете на 1 г корня на 40-е сут было меньше по сравнению c контролем в 2,1 и 1,3 раза при концентрации соответственно 0,5 и 1,0 мг/мл. Самки нематод из корней обработанных растений оказались в 1,2 раза мельче, а число яиц в их ооте-ках уменьшалось на 15-20 % по сравнению с контролем (табл. 3).

3. Рост гетерозисного гибрида томата ( Lycopersicon esculentum Mill.) F₁ Карлсон при заражении галловой нематодой ( Meloidogyne incognita ) и развитие нематод на 40-е сут после обработки вегетирующих растений растворами ама-рантина в разной концентрации ( n = 10, M ±SEM, вегетационный опыт)

Вариант	Масса, г		Балл заражения	Число са-мок/г корня	Размер самок (дли-на½ширина), мм½мм	Число яиц в оотеке
	надземных органов	корней
Амарантин, 0,5 мг/мл	32±1,1*	2,8±0,40	2	324±39,0*	0,300±0,0100*	93±12,0*
Амарантин, 1,0 мг/мл Контроль (зараженные	27±2,4	2,9±0,60	3	544±54,0	0,298±0,0070*	90±17,0*
растения, вода) Контроль (здоровые	24±1,1	3,1±0,70	4	684±46,0	0,354±0,0110	146±22,0
растения, вода)	29±2,8	2,4±0,30

П р и м е ч а н и е. Прочерки означают отсутствие данных в указанном варианте.

* Различия с зараженным контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Балл заражения у растений, обработанных амарантином, был существенно ниже, чем у контрольных. Особенно эффективен оказался раствор в концентрации 0,5 мг/мл, при обработке которым число галлов было в 2 раза меньше, чем на корнях контрольных растений. Зараженные растения, обработанные амарантином в концентрации 0,5 и 1,0 мг/мл, превосходили контрольные по массе надземной части соответственно на 32 % (р ≤ 0,05) и 10 %. Масса корней у зараженных растений, на которых было обнаружено значительное число галлов и даже сингаллов, оказалась заметно больше, чем у здоровых. Соотношение их массы к массе надземных органов (стебля и листьев) также отличалось от показателя у здоровых растений. При воздействии амарантина соотношение массы корня к массе надземных органов было сопоставимо с показателями у незараженных растений, что свидетельствует о нормализации обменных процессов и фи- зиологического состояния томатов.

К числу важных показателей, отражающих физиологический статус растений, относится содержание в хлоропластах фотосинтетических пигментов. В листьях томатов, зараженных нематодой, на 10-е сут количество хлорофиллов увеличилось на 13 %, каротиноидов — на 10 % (табл. 4). Возможно, повышение содержания фотосинтетических пигментов было реакцией на окислительный стресс, вызванный внедрением галловой нематоды в корневую систему. Суммарное содержание хлорофиллов и каротиноидов у здоровых и обработанных амарантином растений было практически одинаковым. На 40-е сут наблюдали снижение количества фотосинтетических пигментов в листьях у всех исследуемых растений (р ≤ 0,05). При этом содержание хлорофиллов в зараженных нематодой растениях уменьшилось на 12 %, каротиноидов — на 15 %, а в обработанных ама-рантином зараженных растениях эти показатели снизились соответственно на 8 и 5 % по сравнению с незараженными.

4. Содержание хлоропластных пигментов в листьях гетерозисного гибрида томата ( Lycopersicon esculentum Mill.) F₁ Карлсон при обработке раствором амарантина в зависимости от времени после заражения галловой нематодой ( Meloidogyne incognita ) ( n = 10, M ±SEM, вегетационный опыт)

Вариант	Время после заражения
	0-е сут	10-е сут	40-е сут
	хлорофиллы каротино-a + b       иды	хлорофиллы каротино-a + b       иды	хлорофиллы каротино-a + b       иды
Амарантин, 0,5 мг/мл 2,35±0,087   0,80±0,025   2,63±0,121   0,90±0,018   2,31±0,074*  0,77±0,011* Контроль (заражен ные растения, вода)    2,29±0,030   0,79±0,042   2,50±0,089   0,83±0,045   2,11±0,144   0,60±0,035 Контроль (здоровые растения, вода)        2,30±0,139   0,81±0,035   2,65±0,145   0,91±0,057   2,40±0,108*  0,80±0,014* * Различия с зараженным контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Более низкое содержание хлорофиллов и каротиноидов в хлоропластах при заражении галловой нематодой (биогенный стресс) указывает на изменения в работе фотосинтетической цепи электронного транспорта у С3-растений томата. В фотосинтетических системах, кроме основной цепи переноса электронов от воды к НАДФ или искусственному акцептору (нециклический электронный транспорт), работает цепь псевдоцикли-ческого транспорта электронов: H₂O → ФС2 → ФС1 → O₂ → H₂O . Псев-доциклический транспорт выступает как альтернативный путь переноса электронов, который приводит к восстановлению молекулярного кислорода и образованию супероксид-аниона и H₂O₂ (23). Известно, что усиление переноса электронов на кислород может происходить в условиях снижения количества окисленного НАДФ или ингибирования темновых реакций фотосинтеза, а также при действии неблагоприятных факторов. Например, в листьях при дефиците воды в хлоропластах перераспределяется поток электронов, связанных с восстановлением CO₂ и O₂ (24, 25).

5. Электронный транспорт по нециклическому (реакция Хилла) и псевдоцикличе-скому пути (реакция Меллера) у гетерозисного гибрида томата ( Lycopersicon esculentum Mill.) F₁ Карлсон на 40-е сут после заражения галловой нематодой ( Meloidogyne incognita ) при обработке раствором амарантина ( n = 3, M ±SEM, вегетационный опыт)

Реакция Хилла, мкмоль Вариант O 2 •мг 1 хлорофилла•ч 1	Реакция Меллера, мкмоль O 2 •мг - 1 хлорофилла•ч - 1
Амарантин, 0,5 мг/мл                             26±3,0* Контроль (зараженные растения, вода)               13±2,0* Контроль (здоровые растения, вода)                  64±4,0 * Различия со здоровым контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.	17±2,0* 22±3,0* 12±2,0

В хлоропластах, выделенных из листьев зараженных растений, резко усиливался (до 67 % при р ≤ 0,05) перенос электронов к молекулярному кислороду по псевдоциклическому пути и снижался — по нециклическому (до 80 % по сравнению с незараженными растениями) (табл. 5). Обработка листьев зараженных растений водным раствором амарантина в концентрации 0,5 мг/мл приводила к уменьшению переноса электронов на молекулярный кислород до 36 % по сравнению со здоровыми растениями, и, соответственно, в хлоропластах усиливался перенос электронов (до 30 %) по нециклическому пути (реакция Хилла).

Обработка амарантином растений, зараженных галловой нематодой, оказывала ауксиноподобное действие: стимулировала рост надземной массы и корней, влияла на содержание хлорофиллов и каротиноидов, а также на скорость переноса электронов по нециклическому и псевдоциклическому пути. Этот факт указывает на то, что молекула амарантина уникальна по своим функциональным свойствам (12, 26).

Заражение растений томата галловой нематодой может ослаблять фотосинтез, в том числе первичные процессы фотосинтеза в тилакоидных мембранах. В хлоропластах при развитии окислительного стресса усиливается фотоокисление, что, возможно, становится причиной переключения потока электронов на участке ФСI с нециклического на псевдоцикличе-ский перенос электронов от воды. С псевдоциклическим транспортом электронов связано образование активных форм кислорода (АФК) — су-пероксидого радикала и H2O2, что усиливает окислительный стресс в хлоропластах. Свободнорадикальное окисление приводит к разрушению органических молекул, следствием чего может быть нарушение метаболизма и даже гибель растений (27). В регуляции количества АФК принимает участие природная антиоксидантная система, представленная низко- и высокомолекулярными соединениями. Мы показали, что в зараженных растениях томата комплекс защитных механизмов, индуцированных действием экзогенного амарантина, включает накопление антиоксидантов-каротиноидов, переключение нециклического транспорта электронов от воды на участке ФСI на псевдоциклический, стимуляцию ростовых процессов. Все это в целом приводит к повышению устойчивости растений томата к галловой нематоде.

Аналогичные данные были получены при изучении действия природного адаптогена — фуростаноловых гликозидов, выделенных из культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall, на системе паразит—хозяин M. incognita —томаты. Обработка семян и вегетирующих растений томата фуро-станоловыми гликозидами заметно снижала поражаемость паразитическими нематодами (7). Препарат оказывал действие на пигментный фонд фотосинтетического аппарата, активность фермента пероксидазы, стимулировал процессы перекисного окисления липидов. Характер изменений в составе хлоропластных пигментов, отмеченный при обработке растений и амарантином, и фуростаноловыми гликозидами, свидетельствует, что эти соединения поддерживают гомеостаз растительной клетки, стимулируя фитоиммунитет самого растения.

Отметим, что исследования, касающиеся поиска природных соединений с нематицидными свойствами, достаточно обширны. Данные о влиянии веществ, полученных из растительного сырья и относящихся к разным классам соединений, на паразитических нематод и устойчивость к ним растений приведены в обзоре D.J. Chitwood (10). Так, индукцию систем- ной устойчивости растений к галловой нематоде отмечали в водных экстрактах из свежих листьев лимонной травы Cymbopogon flexuosus Steud. (28) и при обработке надземной части растений масляным экстрактом из семян Argemone mexicana L. (29). Кресс водяной, а также хрен обыкновенный проявляют антагонистические свойства в отношении M. incognita. Фитопрепараты на их основе имеют высокую нематостатическую активность (подавляют вылупление личинок из яиц и парализуют инвазионные личинки), оказывают стимулирующее и стабилизирующее действие на развитие культурных растений. Предобработка фитопрепаратами, содержащими вещества специализированного обмена с нематицидными свойствами, положительно влияет на ростовые процессы и фотосинтез и негативно — на рост и развитие галловой нематоды.

Таким образом, амарантин обладает адаптогенными свойствами, что проявляется в ослаблении негативных биохимических и функциональных сдвигов при реакциях растений томата на стресс, вызванный инвазией нематодами, и активации синтеза соединений, приводящих к улучшению энергетического обмена и восстановительных процессов. Амарантин в концентрации 1,0 и 0,5 мг/мл, с одной стороны, стимулирует прорастание семян и ростовые процессы у растений томата, образование хлорофиллов и каротиноидов, с другой — ингибирует подвижность личинок нематоды и угнетает их развитие в растениях, что отражается на морфометрических и популяционных показателях нематод. Следовательно, ама-рантин можно рассматривать в качестве нового биогенного индуктора, который в условиях защищенного грунта активирует общие неспецифические системы стрессорного ответа на инвазию фитопатогенов, чем обеспечивает протективный эффект, и при этом обладает ростостимулирующими свойствами.