Действие G-излучения и сканирующего пучка протонов на морфофункциональные характеристики саркомы М-1 крыс

В последние годы в радиационной онкологии всё чаще и успешно применяется протонная терапия (ПТ), которая имеет потенциальное преимущество относительно конвенциальной фотонной терапии и считается одним из наиболее безопасных и эффективных методов лучевого поражения опухолей, расположенных близко к критическим органам [1]. Накопленный клинический опыт подтверждает эффективность ПТ для новообразований разного гистогенеза и локализации, таких как меланома глаза, опухоли центральной нервной системы, хондромы и хондросаркомы основания черепа, опухоли головы и шеи, злокачественные опухоли у детей [2, 3].

Основные предпосылки применения пучков ускоренных протонов для терапии злокачественных новообразований основаны на особенностях глубинного распределения поглощённой дозы протонов с максимумом в пике Брэгга и быстрым спадом дозы за ним практически до нуля в конечной точке пробега этих частиц [2]. Совмещение нескольких пиков Брэгга по глубине позволяет создать модифицированный пик Брэгга, обеспечивающий конформное облучение опухоли [4].

Южаков В.В.* – зав. лаб., к.м.н.; Корчагина К.С. – научн. сотр.; Фомина Н.К. – ст. научн. сотр., к.б.н.; Корякин С.Н. – зав. отд., к.б.н.; Соловьев А.Н. – зав. лаб., к.ф.-м.н.; Ингель И.Э . – ст. научн. сотр., к.б.н.; Корецкая А.Е. – мл. научн. сотр.; Севанькаева Л.Е . – ст. научн. сотр.; Яковлева Н.Д. – вед. научн. сотр., к.б.н.; Цыганова М.Г. – научн. сотр. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Преимущества применения протонного излучения можно использовать для значительного снижения дозы облучения нормальных тканей, расположенных проксимально и дистально относительно облучаемой опухоли. Последнее, в свою очередь, позволяет применить эскалацию доз лучевой нагрузки на опухоли, что потенциально улучшает локальный контроль и выживаемость пациентов, одновременно уменьшая радиотоксичность [1], а при лечении опухолей у детей - снижает интегральную дозу ионизирующего излучения на организм [5].

Изучение радиобиологических эффектов протонов с учётом особенностей распределения их поглощённой дозы в тканях ведётся на всех уровнях - от субклеточного до организменного, тем не менее, нерешённые вопросы всё ещё остаются [6-8]. Так, в настоящее время в протонной лучевой терапии обычно предполагается постоянное значение относительной биологической эффективности (ОБЭ) протонов, равное 1,1, независимо от физических свойств протонных пучков и биологических систем. Однако, по данным многочисленных экспериментальных исследований, обобщённых в обзорах [5, 8] ОБЭ этих частиц по отношению к Y -излучению ⁶⁰Со может варьировать от 0,8 до 1,7 и зависит от величины линейной передачи энергии (ЛПЭ), уровня и мощности подведённой дозы, типа клеток и тканей, исследуемого эффекта, а также меняется по всей протяжённости модифицированного пика Брэгга.

Успех лучевого лечения онкологических заболеваний во многом зависит от резистентности опухолевых клеток к действию ионизирующих излучений. В основе такой радиоустойчивости может лежать гипоксическое состояние клеточной популяции опухоли, повышенная способность опухолевых клеток к репарации радиационных повреждений, а также мутации гена-онкосупрессора р53 [9-11]. Продукт экспрессии гена p53 считается молекулярно-биологическим маркером, позволяющим прогнозировать радиочувствительность злокачественных новообразований. Согласно данным литературы, мутантный белок р53 обладает высокой стабильностью и может накапливаться в ядрах клеток, однако теряет способность контролировать клеточный цикл и запускать механизм апоптоза для элиминации дефектных клеток [12]. Полагают, что радиорезистентность опухолей с mt р53 обусловлена неспособностью излучений с низкой ЛПЭ индуцировать р53-зависимый апоптоз. Более чем у 50% онкологических больных в неоплазиях обнаруживается mt р53 [11]. Тем не менее, сведения о его вовлечении в эффективность ПТ опухолей практически отсутствуют.

Целью данного исследования являлось изучение эффективности воздействия у - и протонного излучений на пролиферативную активность неопластических клеток, их гибель путём апоптоза и васкуляризацию радиорезистентной соединительнотканной опухоли, перевиваемой крысам, с ранее верифицированным нами мутантным онкопротеином р53 [12].

Материалы и методы

Исследования выполнены в соответствии с международными рекомендациями по проведению работ на лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987) на самцах беспородных белых крыс массой тела 150-170 г с привитой под кожу голени саркомой М-1 [12]. Крыс-опухоленосителей распределяли на группы - контрольную (лож-нооблучённые особи) и две опытные. Опухолевые узлы животных 1-й опытной группы подвергали воздействию Y-квантов 60Co в дозе 32 Гр (0,67 Гр/мин). Опухоли особей 2-й группы облучали протонами в дозе 32 Гр на пучке терапевтического комплекса «Прометеус» (Обнинск). План облучения подготавливался встроенной системой планирования протонного комплекса. Модуля- ция облучения по глубине обеспечивалась активным переключением энергии сканирующих пучков протонов синхротрона в диапазоне от 75 до 93,7 МэВ. С учётом точек поперечного сканирования всего в составленном плане было 407 пучков. Для верификации подведённой дозы в исследуемой геометрии облучения использовалась ионизационная камера PTW TM30010 с дозиметром PTW Unidos Webline (Германия). Для контроля равномерности облучения в латеральном сечении использовали радиохромную плёнку Ashland Gafchromic EBT3 (США). Результаты верификации показали хорошую равномерность поля воздействия протонами в пределах ±5%.

Облучение начинали при достижении опухолевыми узлами объёмов 1,2-2,4 см³ на 12 сутки после прививки саркомы. Для оценки эффективности лучевых воздействий использовали показатель коэффициента роста опухолей: « КРО =( V ti - V 0 )/ V 0 , где V ti - объём опухоли (см 3 ) на i сутки от прививки саркомы М-1, а V 0 – объём опухоли в день облучения» [13].

Для изучения морфофункциональных показателей саркомы по 5 особей из каждой группы выводили из опытов в период статистически значимого снижения КРО при действии γ -квантов и протонов через 6 суток после облучения. Опухолевые узлы выделяли под тиопенталовым наркозом. Тканевые пластинки саркомы М-1 фиксировали в жидкости Буэна и после стандартного обезвоживания заливали в парафиновую среду «Гистомикс» (БиоВитрум).

Гистологию саркомы М-1 изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимические (ИГХ) исследования выполняли методом биотин-стрептавидин/экстрави-дин-пероксидазного комплекса с применением кроличьих антител к белку р53 (FL393, «Santa Cruz», 1:50), мышиных антител к PCNA (клон PC10, «Thermo Fisher scientific», 1:100), конъюгированных с биотином, и кроличьих антител к маркеру эндотелия – PECAM-1 (CD31, M-20-R, «Santa Cruz», 1:100). Для иммуновизуализации онкопротеина р53 применяли набор для выявления кроличьих первичных антител (EnVision+System-HRP, K4011, «Dako»). При этом субстратную пероксидазу проявляли аминоэтилкарбазолом (AEC+, «DAKO») с докрашиванием ядер клеток гематоксилином и заключением гистологических препаратов в водорастворимую среду (Faramount, «DAKO»).

Для выявления биотинилированных первичных антител к PCNA на срезы наносили экст-равидин-пероксидазный комплекс («Sigma», 1:400); для антител к CD31 применяли набор (EnVision+System-HRP, K4011, «Dako») согласно прилагаемым инструкциям с проявлением субстратной пероксидазы диаминобензидином (Liquid DAB+, «Dako»).

Объёмное содержание паренхимы опухолей ( V ПО ) как отношение площади паренхимы без зон некроза/деструкции ткани при окрашивании срезов гематоксилином и эозином к площади среза опухолевого узла, объёмную долю паренхимы с PCNA-положительной реакцией ядер опухолевых клеток ( ρ PCNA , отн. ед.) по отношению суммарной площади PCNA-положительной паренхимы к площади среза опухоли и количественную плотность сосудов ( N СОС ) по числу сечений их профилей на 1 мм² в тестовых полях общей площадью не менее 10 мм² в периферических зонах паренхимы опухоли определяли методом сегментации изображений, используя порог интенсивности в полуавтоматическом режиме, и рассчитывали с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений с применением лицензионного программного обеспечения Leica Application Suite.

Гистологические препараты изучали под микроскопом Leica DM 1000 с микрофотосъёмкой на цифровую камеру Leica ICC50 HD. Количественное содержание опухолевых клеток (кле-точность, NОК) по числу сечений их профилей на 1 мм2 площади среза, индексы PCNA (IPCNA, %), нормальных и патологических митозов (IНМИТ и IПМИТ соответственно, %), и апоптоза (IАП, %) опухолевых клеток в паренхиме определяли в тестовых полях общей площадью не менее 0,5 мм2 при иммерсионном увеличении микроскопа. Фракцию клеток с положительной реакцией их ядер на PCNA рассчитывали по формуле «ФPCNA=ρPCNA×IPCNA×КN, где КN=NОК в опыте/NОК в контроле» [14].

Коэффициент эффективности ( К ЭФФ ) действия γ -квантов и протонов на саркому определяли путём нормирования показателя на 1 Гр подведённой дозы: « К ЭФФ =Δ/ D , где Δ =( М КОНТ – М ОП ) – разница в значении среднего показателя между контрольной ( М КОНТ ) и опытной группой ( М ОП ), а D – суммарная подведённая доза, Гр» [12]. ОБЭ сканирующих пучков протонов определяли по отношению нормированных К ЭФФ для протонов и γ -излучения.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США). Непараметрический U-критерий Манна-Уитни использовали для оценки уровня значимости межгрупповых различий полученных показателей. Различия считались достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

На 6 сутки от начала экспериментов КРО в контроле составил 2,60 ± 0,41 (табл. 1). Микроскопически паренхима саркомы М-1 представлена солидными тяжами неправильной формы с очагами некроза в центральных зонах опухолевых узлов (рис. 1 а ). В участках солидного строения опухолевые клетки с крупными ядрами преимущественно овальной формы плотно упакованы (рис. 1 б ). В полях зрения просматривались многочисленные митозы, в том числе и патологические, и отдельные клетки на разных стадиях апоптотической гибели.

Таблица 1

Количественные морфологические характеристики исследованных показателей саркомы М-1 в контроле, через 6 суток после воздействия γ -квантов ⁶⁰Со и протонов в дозах 32 Гр (M ± m)