Dependence of guaiacol peroxidase activity on ph in officinal plant leaves

Пероксидаза – фермент, обладающий выраженным полиморфизмом. Наличие множества изоформ этого фермента позволяет ему работать в разных условиях и выполнять разную функциональную нагрузку (Граскова и др., 2002). Изменения активности, изоферментного спектра и термостабильности пероксидазы отмечают при различных биологических, физических и химических воздействиях на растения (Андреева и др., 1979; Карпец и др., 2009).

Активность пероксидазы зависит от pH, температуры, концентраций субстрата и самого фермента (Kareska, 2009). Известно, что на перикарпе китайской сливы максимальная активность пероксидазы наблюдается при рН 6,5 и 70 ºС, а полифенолоксидазы при рН 6,5–6,75 и 20 ºС (Mizobutsi et al., 2010). Susan Kareska (2009) показано, что максимум активности пероксидазы приходится на рН 7, а минимум на 4. Zolfaghari с соавторами (2010) на буке (Fagus orientalis) показали увеличение активности пероксидазы от июля к сентябрю при отсутствии роста активности каталазы. В то же время считается общепринятой взаимосвязь резистентности растительных тканей к различным тепловым воздействиям и активностью ферментов, обладающих пероксидазной активностью (Müftlügil, 1985; Thongsook, Barrett, 2005).

В этой связи, целью наших исследований было изучить активность гваякол пероксидаз в листьях вероники дубравной, тысячелистника азиатского, одуванчика лекарственного и манжетки городковатой, произрастающих на побережье озера Байкал, в разные сроки вегетационного периода в зависимости от рН в реакционной смеси.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования. Исследовались листья тысячелистника азиатского Achillea asiatica Serg., вероники дубравной Veronica chamaedrys L., одуванчика лекарственного Taraxacum officinale Wigg., манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser, собранных в течение вегетационного периода 2008 года на территории стационара «Речка Выдринная» в июле, августе и сентябре.

Выделение гваякол пероксидаз. Навеску (1 г) ткани помещали в 10 мл холодного цитратно-фосфатного буфера и растирали в фарфоровой ступке при 4 °С (Паду, 1995). Полученный гомогенат центрифугировали при при 3 тыс. об./мин. в течение 15 мин. Супернатант использовали для определения активности фермента.

Определение пероксидазной активности. Активность растворимых пероксидаз в листьях растений определяли по изменению оптической плотности (длина волны 580 нм) в реакционной смеси следующего состава: 0,5 мл 0,1 М цитратно-фосфатного буфера (рН от 4,0 до 7,0 с шагом 0,2), 0,5 мл 0,3 % перекиси водорода («Реахим», Россия), 0,5 мл 0,05 % гваякол (Sigma, США) и 0,5 мл пробы (1г пробы растирали в 10 мл Цитратно-фосфатного буфера рН 5,5).

Активность пероксидазы определяли при 25 °С сразу после выделения ферментов из образцов. Активность фермента рассчитывали по методу Бояркина (Бояркин, 1951) и выражали в условных единицах на мг сырого веса тканей по формуле: А = ∑ (α β γ)/d t, где ∑ - экстинция (0,125), α – отношение количества буфера, взятого для приготовления вытяжки в мл к весу сырой ткани, β – степень дополнительного разведения вытяжки в реакционной смеси, γ – степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси, d – толщина поглощающего слоя кюветы, t – время реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Впервые была изучена активность гваякол пероксидаз при разных значениях рН в листовых пластинках тысячелистника азиатского Achillea asiatica Serg., вероники дубравной Veronica chamaedrys L., одуванчика лекарственного Taraxacum officinale Wigg., манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser (рис. 1).

Для вероники дубравной (рис. 1-А) и манжетки городковатой (рис 1-Г) наблюдали уменьшение активности пероксидаз с июля по сентябрь, в то время как для тысячелистника азиатского (рис. 1-Б), наоборот, увеличение. Для одуванчика лекарственного (рис. 1-В) минимум нейтральных пероксидаз приходился на сентябрь, слабокислых на июль, а кислых на август.

Соответственно, в июле в листьях одуванчика преобладали нейтральные гваякол пероксидазы с оптимумом рН 6,6-6,2 и кислые с оптимумом рН 4,8-4,6. В августе у одуванчика лекарственного повышалась активность слабокислых пероксидаз с оптимумом рН 5,8. К сентябрю максимальная активность гваякол пероксидаз у этого растения сохранялась при рН 5,8, но этот пик активности значительно ниже, что характеризует понижение активности фермента и истощение адаптационных ресурсов осенью у этого вида.

Активность пероксидазы,              Активность пероксидазы,               Активность пероксидазы,               Активность пероксидазы, усл, ед./г сырой массы                усл. ед./г сырой массы                 усл ед/г сырой массы                 усл. ед./г сырой массы

Рисунок 1. Активность общих кислых, слабокислых и нейтральных гваякол пероксидаз в листьях вероники дубравной (А), тысячелистника азиатского (Б), одуванчика лекарственного (В) и манжетки городковатой (Г) на побережье озера Байкал, стационар «речка Выдриная», 2008 г. 1 – июль, 2 – август, 3 – сентябрь

Таким образом, выраженное увеличение активности всех изученных пероксидаз с наступлением неблагоприятных условий произрастания в сентябре наблюдали только у тысячелистника азиатского, что может свидетельствовать о его холодоустойчивости и высоком адаптационном потенциале по отношению к гипотермии. Причем, если в июле у тысячелистника оптимум рН приходился на 6.2, с наступлением августа этот пик перекрывали пероксидазы с активностью при рН 7.0-6.8, 5.8 и 5.0, что может косвенно свидетельствовать о начавшейся экспрессии соответствующих форм фермента. К октябрю все три указанных пика еще сильнее возрастают и дополняются еще одним – 4,6. Минимум активности фермента в сентябре приходится на рН 6.2.

Интересна активность разных групп пероксидаз у манжетки. У нее во все сроки исследований наблюдается общая закономерность: активность кислых пероксидаз была ниже нейтральных и слабокислых гваякол пероксидаз.

Для вероники на фоне общего уменьшения активности пероксидаз с наступлением осени выделяются стабильные пики при рН 6.8-6.6, 5.8, 5.4-5.2, 4.6-4.2, что может свидетельствовать о стабильности изоферментного состава пероксидаз у этого вида в течение всего исследуемого периода вегетации. Для вероники наблюдается совпадающее с литературными данными уменьшение активности фермента в ряду рН от 7 к 4 (Mizobutsi et al., 2010; Kareska, 2009).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В листьях тысячелистника азиатского, вероники дубравной, одуванчика лекарственного и манжетки городковатой впервые была изучена активность пероксидаз в зависимомти от рН.

Для вероники дубравной и манжетки городковатой наблюдали уменьшение активности фермента с июля по сентябрь, а для тысячелистника азиатского, наоборот, увеличение. Для одуванчика лекарственного минимум нейтральных пероксидаз приходился на сентябрь, слабокислых на июль, а кислых на август. Для вероники наблюдали уменьшение активности фермента в ряду рН от 7 к 4.