Деструкция бенз(а)пирена в почве штаммом Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия

Бенз(а)пирен (БП) является одним из наиболее токсичных представителей полициклических ароматических углеводородов. Он относится к веществам первого класса опасности [ГОСТ 17.4.1.02-83], обладает мутагенной и канцерогенной активностью, негативно влияет на иммунную и репродуктивную системы человека [Busbee et al., 1984; Irwin et al., 1997]. Основное количество БП в биосфере образуется в процессах горения, образующийся БП попадает в атмосферу, из которой с осадками поступает в почву, БП также попадает в почву с загрязнением нефтью и нефтепродуктами [Фелленберг, 1997; Киреева и др., 2009]. Вследствие очень высокой устойчивости БП происходит его накопление в почве [Киреева и др., 2009]. В

настоящее время существуют достаточно противоречивые сведения о разложении данного соединения в почве, кроме того, данные о бактериях-деструкторах БП очень немногочисленны.

Способность к деструкции БП обнаружена у бактерий Mycobacterium sp. [Schneider et al., 1996], Sphingomonas paucimobilis [Ye et al., 1996], Stenotrophomonas maltophilia [Juhasz, Stanley, Britz, 2000], Rhodanobacter sp. [Kanaly, Harayama, Watanabe, 2002], Rhizobium tropici [Yessicaa et al., 2013], Ochrobactrum sp. [Yirui et al., 2009].

Известно, что представители рода Rhodococcus могут разрушать широкий спектр ароматических соединений [Solyanikova et al., 2008]. Однако деструк-ционная активность родококков по отношению к БП в настоящее время изучена недостаточно.

Цель данной работы – оценка способности штамма Rhodococcus wratislaviensis Ch625 к деструкции БП в почве.

Материал и методы исследования

Штамм КТ112-7 был выделен из техногенноминеральных образований предприятия БКРУ1 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) и определен как Rhodococcus wratislaviensis [Егорова и др., 2013]. Ранее было установлено, что данный штамм является активным деструктором ароматических соединений (фенантрена, нафталина, бифенила, бензола, толуола, фенола, ортофталевой и бензойной кислот) [Егорова и др., 2013].

Для эксперимента была использована дерновоподзолистая почва, отобранная с территории биостанции (д. Ключи Добрянского р-на, Пермский край) и технозем с окраины (г. Соликамск, Пермский край). Почву высушивали до воздушносухого состояния, просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм, вносили в нее в сухом виде БП в дозе 100 мг/кг и гомогенизировали полученную смесь растиранием в ступке. Приготовленную почву в количестве 100 г помещали в пластиковые контейнеры, закрывающиеся крышками размером 60×85×45 и увлажняли до 60% от ее полной влаго-емкости. Затем к загрязненной почве добавляли клетки штамма Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, плотность клеток составляла 10⁸ кл/г почвы. Для эксперимента бактерии выращивали на минеральной среде К1 следующего состава (г/л): K 2 HPO 4 × 3H 2 O – 4.0; NaH 2 PO 4 × 2H 2 O – 0.4; (NH 4 ) 2 SO 4 – 0.5; MgSO 4 × 7H 2 O – 0.15; Ca(NO 3 ) 2 × 4H 2 O – 0.01; NaMoO 4 × 2H 2 O – 0.18, FeSO 4 × 7H 2 O – 1.98, дополненную 1 мл/л раствора микроэлементов, содержащего (г/л): ЭДТА – 2.50, ZnSO 4 × 2H 2 O – 10.95, FeSO 4 × 7H 2 O – 5.0, MnSO 4 × 2H 2 O – 1.54, CuSO 4 × 5H 2 O – 0.39, Co(NO 3 ) 2 × 6H 2 O – 0.24, Na 2 B 4 O 7 × 10H 2 O – 0.17; рН среды 7.3 [Зайцев, Карасевич, 1981], с добавлением 1 г/л бензойной кислоты.

В ходе эксперимента оценивали уменьшение концентрации БП, а также численность внесенных бактерий.

Концентрацию БП и других углеводородов измеряли в хлороформенных экстрактах на хромато-масс-спектрометре Agilent 6890/5973N (Agilent, США), с кварцевой колонкой RESTEK RTx-5MS (Restek, США). В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока составляла 1 мл/мин. Температура испарителя 280°С. Программирование подъема температуры осуществляли от 60 до 280°С со скоростью 10°С/мин. Анализ хроматограмм проводили программой MSD ProductivityChemStation (Agilent, США).

Количественный учет микроорганизмов в почве проводили методом посева почвенной суспензии на агаризованную среду с последующим подсчетом колоний (колонии образующих единиц, КОЕ) [Методы почвенной…, 1991]. Для учета микроорганизмов использовали минеральную среду Раймонда: NH 4 NO 3 – 2, MgSO 4 × 7H 2 O – 0.2, KH 2 PO 4 – 2, Na 2 HPO 4 – 3, Na 2 CO 3 – 0.1, CaCl 2 × 6H 2 O – 0.01 [Raymond, 1961] с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта. Для получения ага-ризованных сред вносили агар («Sigma», США) 15 г/л.

Результаты и их обсуждение

Внесение бактерий штамма R. wratislaviensis KT112-7 в почву положительно влияло на ее очистку от БП (рис 1, 2). При этом установлено, что в техноземе при инокуляции бактерий деструкция БП протекала быстрее, чем в дерновоподзолистой почве. Так, в техноземе концентрация БП снизилась через 1 месяц на 45.4%. В дерновоподзолистой почве содержание БП через 1 месяц уменьшилась на 26.1%, снижение концентрации БП на 43.7% было отмечено через 4 месяца. Данное отличие было связано с большим содержанием углеводородов в техноземе. Так, количество алканов в техноземе составляло 145 мг/кг, в дерново-подзолистой почве – 37 мг/кг.

почва с внесением бактерий ■ почва без внесения бактерий

Рис. 1 . Влияние внесения штамма R. wratislaviensis KT112-7 в дерновоподзолистую почву на деструкцию БП

Известно, что БП не используется бактериями в качестве единственного источника углерода и энергии, поэтому для его биодеградации в среде необходимо наличие косубстратов, например, нефти, нефтепродуктов, доступных для бактерий полициклических углеводородов, обеспечивающих рост и жизнедеятельность бактерий-деструкторов, а также соокисление (кометаболизм) БП [Бабошин, Головлева, 2012].

почва с внесением бактерий ■ почва без внесения бактерий

Рис. 2 . Влияние внесения штамма R. wratislaviensis KT112-7 в технозем на деструкцию БП

Так, ранее было выявлено снижение концентрации БП в 2 раза в течение 24 ч. в морской воде при добавлении водного экстракта из мазута, в то время как без добавления экстракта деструкция БП не была обнаружена в течение 48 ч. [Verschueren, 1983].

Обнаружено, что при внесении бактерий в дерново-подзолистую почву через 2 и 4 месяца численность R. wratislaviensis KT112-7 стабилизируется на уровне 8.0×106 – 9.5×107 кл/г (рис. 3). Однако с течением времени отмечается снижение доли внесенных бактерий рода Rhodococcus в общей численности почвенных бактерий в течение проведения эксперимента. Если через 2 недели опыта доля бактерий рода Rhodococcus в общей численности почвенных гетеротрофных бактерий составляла 100%, через 2 месяца – 84%, через 4 месяцев – 29%.

• ■    численность бактерий R. wratislaviensis КТ 112-7

• ■    общая численность гетеротрофных бактерий Рис. 3 . Численность бактерий в дерновоподзолистой почве после интродукции

штамма R. wratislaviensis KT112-7

Для оценки воздействия наличия косубстратов в почве на деструкцию БП штаммом R. wrati- slaviensis KT112-7 был проведен эксперимент с дополнительным добавлением бензойной кислоты в количестве 100 мг/кг. Для эксперимента использована дерново-подзолистая почва, отобранная с территории биостанции д. Ключи Добрянского р-на Пермского края.

Внесение бензойной кислоты приводило к увеличению биодеградации БП бактериями R. wrati-slaviensis KT112-7, через 1 месяц после начала эксперимента концентрация БП снизилась здесь на 43.9%, через 2 месяца – 62.1% (рис. 4). При этом без внесения бактерий в почву бензойная кислота не оказывала положительного влияния на биодеградацию БП.

почва с внесением бактерий ■ почва без внесения бактерий

Рис. 4 . Влияние добавления бензойной кислоты в дерново-подзолистую почву на деструкцию БП

Ранее соокисление БП бактериями было обнаружено в культуральных средах в присутствии дизельного топлива [Kanaly et al., 2000], флюоранте-на, нафталина [Ye et al., 1996], пирена [Ye et al., 1996; Boonchan, Britz, Stanley, 2000], фенантрена [Aitken et al., 1998], дрожжевого экстракта, пептона, глюкозы, крахмала [Ye et al., 1996; Schneider et al., 1996].

Заключение

Таким образом, полученные результаты указывают на способность штамма Rhodococcus wratisla-viensis KT112-7 к деструкции БП в почве в присутствии органических веществ, которые штамм может использовать в качестве субстрата. Данный штамм может быть применен для разработки биотехнологий очистки окружающей среды от БП.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.