Деструкция биопленок коагулазонегативных стафилококков под действием бактериальных катионных пептидов

Уникальные биологические особенности бактерий, такие как наличие разнообразных механизмов адаптации к постоянно меняющимся параметрам сре-ды： позволяют их подавляющем}7 большинству' сохранять жизнеспособность и поддерживать опреде-пенную численность тюпуляции даже в самых экстремальных и агрессивных условиях. Одними из самых значимых адаптивных свойств бактерий является их способность формировать биопленки на грани цах раздела фаз, а также быстрое формирование устойчивости к токсичным соединениям и, в частности, к антибиотикам. В настоящее время считается, что эти два чрезвычайно важных проищи взаимосвязаны, поскольку развитие а нгибиотикорезистентности бактерий в составе биопленки происходит значительно быстрее [Лямин и др. 2012].

Широкое применение б медицинской практике биоматхриалов и искусственных устройств (дре-

电 Коробов В. П., Лемкина Л. М., Полюдова Т. В., 2015

нажи* катетеры, сетки, протезы) способстБует формированию на их поверхностях бактериальных биопленок и повышает риск распространения инфекции в организме [Псрспанова, 2013]. Заболевания, обусловленные биоматсриал-ассоциированны-ми инфекциями, требуют более тщательного подбора доз антибактериальных препаратов, поскольку минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков для бактерий в составе биопленок значительно превышают таковые для планктонных клеток [Frank et al.. 2007]. Учитывая высокую приспособляемость бактерий к антибиотическим соединениям, наиболее остро стоит вопрос о поиске средств, эффективно препятствующих образованию биопленок и способствлтощих разрушению зрелых бактериальных пленок. К группе таких соединений, по-видимом>; моп^гт быть отнесены антибактериальные катионные пептиды, выделяемые всеми живыми организмами, в том числе, и самими бактериями [Коробов, 2011; Jorge et al, 2012]. Для катионных пептидов варнерина и хоминина, выделенных из коагу^глазонегэтивных стафилококков, показана высокая эффективность предотвращения адгезии к полистирол бактерий Staphylococcus epidermidis [Eroshenko. Korobow 2015] и Propion / b acien if tn acnes [Полюдова и др. 2015]_t

Целью настоящей работы явилось изучение динамики формирования биопленок на поверхности полистирола чувствительными и антибиотикорезистентными бактериями разных штаммов коаг ) ла- 而 негативных стафилококков (КНС)* а также экспериментальное обоснование возможности применения а нтиба ктериа льных пептидов варнерина и хомнннна для предупреждения пленкообразования и разрушения зрелых биопленок КНС.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали ба ктерии коа г^лазонегативных стафилококков (КНС): Staphylococcus epidermidis ГИСК 33 (「 осу-дарственная коллекции патогенных микроорганизмов Государственного на^но-исследователь-ского ннстнтута стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов, Москва), полученный селекционным путем штамм, устойчивый к ципрофлоксацину' 5 ： epidemidis ЗЗ-Cf¹ [Коробов и др., 2015]. Кроме того, при скрининге более 1000 клинических штаммов КНС, обладающих резистентностью к антибиотикам, был выделен штамм стафилококков, обладающий устойчивостью к 10 антибиотикам. Штамм получил лабораторный порядковый номер 831. Проведенная процедура идентификации с использованием диагностического набора StaphVest 24 (Lachema, Чехия), позволила отнести эти бактерии к вш^у У xyhsus.

Культивирование микроорганизмов проводили на модифицирова иной жидкой богатой питательной среде Luria-Bertani (LB), содержащей (г/л):

триптон (Sigma) - 10.0, дрожжевой экстракт (Sigma)-5 Д КС1-64

Планктонные культуры стафилококков выращивали при 37℃ на ротационном шейкере CERTOMAT IS (Sanorius, Германия) при 150 об/мин. Интенсивность роста в жидких к>^гльту^грах оценивали по оптической плотности при длине волны проходящего света 600 нм (口 D^J на спек-тро 巾 отометре PD-3O3 (Япония).

Культуры бактерий, выращенные на среде LB до середины лог-фазы, разводили свежей питательной средой до оптической плотности OD^oo 0.015 (107^КОЕ/мл) и вносили по 100 мкл в лунки плоскодонных полистироловых планшетов (Мед-полимер* Россия). Культивирование проводили в течение 15 сут при 37℃ в термостате. Далее планктонные клетки аккуратно удаляли, лунки дважды промывали 200 мкл 10 мМ фосфатного буфера (pH 7.2).

Для оценки влияния антибактериальных пептидов на формирование биопленок; в лунки планшетов одновременно вносили по 90 мкл среды LB с растворенными в ней препаратами варнерина или хоминина в количестве 8-128 мг/мл. После чего добавляли 10 мкл индикаторных бактериальных культур, содержащих 10⁶> ： КОЕ/мл.

Для изучения влияния пептидов на уже образовавшиеся биопленки растворы варнерина и хоми-нтна в LB вносили в ^^гнки с Отмыты\ги ^иопден-ками и культивировали в течение 24 ч. В контрольном варианте биопленки инкубировали с0.14 М раствором NaCl. Затем из jij hok планшетов удаляли жидкую часть, лунки промывали фосфатным буфером и подсушивали. Далее для определения биомассы пленок б каждую лунқу планшета вносили по 100 мкл 0.1%-ного раствора генцианвио-лета в 0.14 М растворе NaCl_? выдерживали 20 мин.. 箍 тем краситель удаляли, лунки дважды промывали фосфатным буфером, высушивали, и производили экстракцию связавшегося с биопленками красителя 96%-ным этанолом (100 мкл на лунку) в течение 20 мин. Количественную оценк5^г этанольных экстрактов осуществляли на микропла ншетнойі спектрофотометре Benchma rk Plus ， (Bio-Rad, США) при длине волны 570 нм.

Для определения жизнеспособности клеточных элементов окрашивание биопленок проводили тег-разолием с использовиниейі системы Cell Proliferation Assay в соответствии с инструкцией фирмы (Prainega, США). В каждую лунку на отмытые от срепы биопленки бактерий вносили по 100 мкл во ды, добавляли 20 мкл реакционной смеси и инкубировали 4 ч. при 37℃. Интенсивность окраски измеряли на м икропланшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad? США) при длине волны 490 нм.

Поста новк5г антибактериального теста проводи- ли методом серийных разведении в стерильных иммунологических планшетах (Медполимер. Россия). В лунки планшетов вносили по 100 мкл среды LB, не содержащей КС1. В первою лунку ряда вносили 100 мкл исследуемого раствора антибактериальных пептидов и готовили серию двукратных разведений. Затем в каждою лунку вносили по 10 мкл суспенмнм бактерий, содержащей 10б>^КОЕ/мл (в качестве инокулятов использовали клетки лог-фа^ы роста).

При подсчете минимальных подавляющих концентраций (МПК) пептидов для разных бактерий_һ учитывали их известное значение МПК для бактерий S. epidermidis ГИСК 33* составляющее 0.25 мкг/мл (как для варнерина. так и для хоминина). При расчете количеств пептидов необходимых для подавления роста антибиотикорезистентных бак-т€рий, учитывали максимальное разведение, при котором наблюдалось отсутствие роста через 16-18 4. инкубации и сраЕннЕалп с разведеним, ингибирующим рост S. epidenftidis ГИСК 33.

Определение антибиотикорезистентности проводили ДИСКОДиффу зионным методом согласно Методическим указаниям [МУК, 2004]. Для постановки тестов использовали бактерии лог-фазы роста и диски, пропитанные стандартными растворами антибиотиков (НИЦФ, Россия). Чувствительность к антибиотикам определяли по диаметру зон подавления роста колоний исслед>гемых бактерий.

Повторность всех экспериментов трехкратная. Статистическою обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2000 (Microsoft Inc+, 1999). рассчитывая среднее арифметическое значение и стандартное отклонение.

Результаты и обсуждения

Диско-диффузионный метод определения анти-биотикочувствительности исследуедіых штаммов показал, что бактерии штамма S epideruudis ГИСК 33 обладают ВЫСОКОЙ чувствительностью ко всем щученным антибиотикам, кроме клиндамицина (табл, 1).

Бактерии S epidmnidis 33 Cf проявляли устой-чивось к ципрофлоксацин), и новобиоцину, а бактерии полирезистентного клинического штамма S xylosus S31 были устойчивы к 10 антибиотикам, но обладали низкой чувствительностью к амикацину, оксациллину и ципрофлоксацину (табл, 1).

Таблица 1

Антибиотикочувствите<чьность бактерий исследуемых штаммов КНС (диаметр $ин подавления роста, мм)

Антибиотик S. epidermidis 33 S. epidermidis 33 Cf S. xylosus 831 Ами[<ацин 26±0.2 27士U.3 19±0.2 Бензилпенициллин 45±032 44±0.4 0 Ванкомицин 2U0.2 20±0.2 0 Гентамицин 22±0.1 20i0.2 9±0Л Канамицин 15±0.2 16i0/ 0 Клиндамицин 0 28i0.2 28i0.2 Линкомицин 21±02 25i().2 2()±0.2 Линезолид 33±0.4 32±0.3 30i03 Меропенем 36±0,4 36І0.4 9i0,1 Новобиоцин 15МЗ 0 24现.2 Оксациллин 21=ЬО,2 20М),2 16=Н),2 Рифампицин 32M3 35М),4 334ЮЗ Рокситромицин 29±0,3 3O±O,3 0 Фузидин 24±0,2 23±0.2 30±0.4 Цефа золин 33±0,3 35±0.3 0 Цефалексин 30±0,3 34±0.4 0 Це(|жклор 24±0,3 26±0.2 0 Ципрофлоксацин 25±0,3 0 14±0.2 Эритромицин 27i03 26±0.3 0 р«05 (уровень значимости 1-крит^рия Стьюдента).

Изучение чу ветвите льности планктонных культур исследуемых стафилококков к катионным пептидам варнерину и хоминину [Коробов и др+ 2010“ 2014] показало, что минимальная подавляющая концентрация (МПК) пептидов значительно различается для разных штаммов. Из представленных данных ВИДНО. ЧТО наибольшей Ч) БСТБИТеЛЬНОСТЬЮ к катионным антибактериальным пептидам обладали бактерии вида S. epiden?iidis, а с приобретением устойчивости к ципрофлоксацину незначительно снижалась чувствительность ЛИШЬ К катионному пептиду хоминину. При действии на поли- резистентный штамм S xytcsus 831 варнерин и сниженной ч^ъствительности этих бактерий к дан-хоминин проявляли активность при значительно ным соединениям (табл. 2).

больших конце игра циях^ св идете льств >ю щих о

Таблица 2

Минимальная подавляющая концентрация анпгбактернальны\ катионные пептидов лл 篇 исслелонанных штаммов КНС (мкг/мл)

Пептид	S.epidefmidis ГИСК 33	S.epidermidis ГИСК 33 Cf	S. xy^osus 831
Варнерин	0.25	0.25	1000
Ходіинин	0.25	S5	1000

При изучении способности бактерий формировать биопленки на поверхности полистирола было показано, что динамика роста биомассы пленок и количества живых клеток в них различаются у разных штаммов.

Биомасса пленок бактерий S. epidevmidis ГИСК 33 г и численность живых клеток в них достигали максимума уже 'іерез 24 ч₊ При дальнейшем к ) ^тль-тиБировании наблюдалось снижение обоих показателей. Важно отметить, что на фоне постепенного падения биомассы пленок происходило резкое снижение содержания в них жизнеспособных кле-

Рис. 1. Динамика роста биопленок

5 ： epidemidis ГИСК 33:

А - число живых клеток в биоплснке; В -биомасса плеіпси

Несколько иная картина динамики развития биопленок была характерна для бактерий £ epidermidis ГИСК 33 С 产， устойчивых к ципрофлоксацину, В это^< случае максимумы биомассы пленок и количества живых клеток в них также достигались уже через сутки. При дальнейшем ку л ьтив ирова нии наблюдалось резкое снижение биомассы пленок_? однако, количество живых клеток в них продолжало возрастать (рис. 2).

Снижение биомассы пленок бактерий S epi-dermidis ГИСК 33. вшможно. было связано с истощением питательных веществ в среде и разрушением по лисахар идного матрикса собственными литическими ферментами, которые присутствуют в клеточных стенках данного штамма стафилококков [Коробов и др., 2010].

Формирование биопленок бактериями полире-зистентного штамма S xylosus 831 происходило более длительное время (рис. 3)₊ Максимальны* значений биомасса пленок достигала лишь на ЗТ-е сут₊ культивирования* Следует отметить* что перманентный рост биопленок S xy^osus 831* ха-рактери^овалея двумя фазами увеличения их биомассы и содержания жизнеспособных клеток - фазой быстрого роста (1 сут) и фазой стабилизации этих показателей (2-4 сут.)₊

Рис. 2* Динамика роста биопленки S epidermidis ГИСК 33 Cf:

А - число живых клеток в биоплеіЕке. В -биомасса пленки

Рис. 3* Динамика роста биопленки Sxylostis 831:

А - число живых клеток в биоппенке, В -биомасса пленки

Для определения влияния варнерина и хомини-на на способность бактерий к образованию биопленок. одновременно с инок\тлумом в питательную среду добавляли эти антибактериальные пептиды. Согласно полученным данным, наличие в среде роста стафилококков варнерина или хоми-нина. приводило к значительному уменьшению биомассы пленок (рис. 4) и количества жизнеспособных бактериальных клеток в сформированных в течение 1 сут. биопленках (рис. 5).

Рис. 4. Формирование биомассы пленок стафилококков в течение суток в

биопленках стафилококков, выращенных в течение суток в присутствии катионных

пептидов

Важным практическим аспектом поллненных результатов является факт ингибирокшия процесса пленкообразования полирезистентных бактерий клинического изолята S xylosus 831.

Однако известно, что бактерии в составе биопленок имеют повышенную выживаемость в при-сутствми антибактериальных веществ, позтому важно было исследовать влияние низкомолекулярных катионных пептидов на сформировавшиеся в течение суток биопленки использованных в работе штаммов стафилококков. Влияние низкомолекулярных катионных пептидов на зрелые биопленки было обнаружено после их инкубации с пептидами в течение суток.

Из представленных на рис. 6 и 7 данных видно, что при наличии в среде пептидов как биомасса суточных пленок исследованных штаммов КНС. так и жизнеспособность их клеточных элементов значительно снижаются.

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют о том. что использованные в работе катионные пептиды проявляют свое действие и на с ( {юрмированных бактериальных пленках, снижая их

Рис. 6. Разрушение биомассы суточных биопленок стафилококков при действии

при действии катионных пептидов на сутохіные биопленки стафилококков

Результаты проведенного исследования позволяют сделать следующие выводы:

• 1.    Изученные штаммы коагулазонегативных стафилококков S. epidermidis ГИСК 33, S. epider-midis ГИСК 33 Cf и 5. xylosus 831 обладают выраженной способностью к образованию биопленок. Динамика формирования клеточных и неклеточных компонентов биопленок бактерий исследуе-

• ммх штаммов существенно различается.

• 2.    Присутствие в среде роста низкомолекулярных катионных пептидов варнерина и хоминина подавляет развитие биопленок бактерий всех исследованных штаммов стафилококков.

• 3.    Бактериальные катионные пептидоы вызывают деструкцию зрелых биопленок КНС. в том числе и полирезистентного клинического штамма S. xylosus 831.

Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ № 14-04-0068 7. Программ фундаментальных исследований УрО РАН и Министерства образования и науки Пермского края -«Межлугнародные исследовательские группы», № С-26/632.