Деструкция фталевых кислот штаммом Paenarthrobacter sp. SA101, выделенным из сточных вод химического предприятия

Фталевые кислоты – двухосновные ароматические карбоновые кислоты, существующие, в зависимости от положения карбоновых групп, в трех изомерных формах: фталевой ( орто -фталевой, ОФК), изофталевой и терефталевой (ТФК) кислот. Фталаты и сложные эфиры фталевых кислот имеют повсеместное применение в промышленности, используются в качестве пластификаторов для получения полимерных материалов. Эфиры фталевой кислоты (дибутилфталат, диметилфталат, диэтилфталат) используются для пластификации поливинилхлорида (ПВХ), при синтезе полиэфирных волокон, полиэтилена, а также в производстве строительных и смазочных материалов, лаков, косметики [Liang et al., 2008; Gao et al., 2018]. Терефталевая кислота (с пара- расположением карбоксильных групп) применяется в производстве насыщенных полиэфиров, химических волокон, пластмасс, красителей. ТФК является основным исходным соединением для получения полиэтилентерефталата (ПЭТФ), который составляет 90% от общего производимого количества насыщенных полиэфиров [Zhang et al., 2005; Karthik et al., 2008]. Фталаты и их эфиры не связаны ковалентно с пластиковым полимером и выщелачиваются в окружающую среду, представляя угрозу для здоровья человека и животных. Хотя фталаты подвергаются абиотическому фотолизу с периодом полураспада от месяцев до нескольких лет, микробная деградация является основным и экологически безопасным методом утилизации фталатов [Benjamin et al., 2015; Wang et al., 2023].

К настоящему времени биодеградация ОФК, ТФК и их сложных эфиров описана для ряда бактерий различных филогенетических групп, в том числе для штаммов рода Arthrobacter и для принадлежащих ранее к данному роду бактерий, реклассифицированных как представители родов Pseudoarthrobacter, Glutamicibacter, Paenarthrobacter [Eaton 2001; Stanislauskienė et al., 2011; Chen et al., 2021; Shariati et al., 2022; Ren et al., 2023]. Однако среди бактерий рода Paenarthrobacter способность к утилизации фталатов описана лишь для штамма Paenarthrobacter sp. Shss., растущего на ОФК, а также дибутилфталате (1 г/л) и других эфирах фталевой кислоты [Shariati et al., 2022]. Утилизация ОФК и ТФК аэробными бактериями проходит с образованием протокатеховой кислоты как ключевого промежуточного метаболита. При этом разложение ОФК до протокатехата проходит в три этапа: диоксигенирование, дегидрирование и декарбоксилирование; а деградация ТФК до протокатехата включает только две стадии, поскольку декарбоксилирование осуществляется цис -дигидродиолдегидрогеназой. Протокатехат в дальнейшем расщепляется диоксигеназами по орто- , либо мета- пути [Dagley et al., 1971; Liang et al., 2008; Boll et al., 2020].

Материалы и методы исследований

Объект исследования и условия культивирования. Из рабочей коллекции Лаборатории микробиологии техногенных экосистем «Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ПФИЦ УрО РАН для исследований отобран штамм SA101, способный к росту на фталатах.

Культивирование бактерий проводили в минеральной среде К1 [Зайцев, Карасевич, 1981] с добавлением ОФК или ТФК в концентрациях 1, 10, 20, 30, 40 г/л. В качестве инокулята использовали бактериальные клетки в экспоненциальной фазе роста, выращенные в среде К1 с ОФК или ТФК (1 г/л) в качестве субстрата. Бактериальные культуры выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем среды – 100 мл) при 28°С, на термокачалке при 100 об/мин.

Определение оптической плотности (ОП) культуральной жидкости проводили на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini (“Shimadzu”, Япония) при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Расчет удельной скорости роста (μ, ч^-1) проводили по стандартной формуле

μ = (ln B 2 – ln B 1 )/( t 2 - t 1 ), где В 1 и В 2 – оптические плотности культуры в моменты времени t 1 и t 2 , соответственно [Нетрусов, 2005].

Убыль ОФК и ТФК из среды культивирования определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографа LC-20AD Prominance (“Shimadzu”, Япония) с колонкой (С-18 150 × 4.6 мм; “Shima-Aldrich”, США) и УФ-детектором SPD-20A (при 205 нм) в системе ацетонитрил – 0.1%-ная H 3 PO 4 (70 : 30). В качестве подвижной фазы использовали 80%-ный раствор ацетонитрила при скорости потока 1.0 мл/мин и температуре 40ºС. Идентификацию соединений проводили при сравнении времени выхода пиков экстрактов со стандартными растворами ОФК и ТФК в концентрациях 50 и 100 мг/л. Количественное содержание рассчитывали с помощью пакета программ “LCsolution” (“Shimadzu”, Япония). Расчет удельной скорости ( μ , ч^-1) утилизации ОФК и ТФК проводили по стандартной формуле

μ = (ln С 1 – ln C 2 )/( t 2 - t 1 ), где С 1 , С 2 – концентрация субстрата в начальный и конечный момент времени t 1 и t 2 соответственно [Не-трусов, 2005].

Наличие плазмидной ДНК выявляли модифицированным методом щелочного лизиса [Marko et al., 1982].

Результаты и их обсуждение

Штамм SA101 выделен ранее из образца сточных вод химического предприятия (г. Пермь) и идентифицирован как представитель рода Paenarthrobacter, близкородственный виду Paenarthrobacter ureafa-ciens NC^Т (NR 029281) (уровень сходства по гену 16S рРНК составил 99.3%) [Малышева, Ястребова, Плотникова, 2021].

Установлено, что штамм Paenarthrobacter sp. SA101 способен к деструкции ряда ароматических углеводородов и фталатов, в том числе ОФК, ТФК, дибутилфталата, бензоата [Малышева и др., 2021]. На основании способности штамма SA101 к росту на протокатеховой кислоте можно предположить, что штамм осуществляет утилизацию ОФК и ТФК через образование протокатехата – ключевого метаболита фталатов, с расщеплением последнего до основных клеточных метаболитов [Liang et al., 2008; Boll, 2020].

Исследована способность штамма использовать в качестве единственного источника углерода и энергии ОФК и ТФК (в концентрациях 1, 10, 20, 30 г/л) при росте в минеральной среде К1. Установлено, что штамм SA101 растет на данных субстратах в концентрациях до 20 г/л. Увеличение концентрации обоих субстратов приводило к накоплению биомассы, при этом в средах с ОФК были зафиксированы более высокие параметры роста штамма, чем в средах с ТФК (рис. 1). Максимальное значение ОП 600 (1.64), наиболее высокая удельная скорость роста (0.073±0.003 ч^-1) и наименьшая продолжительность лаг-фазы роста штамма наблюдались в среде с 10 г/л ОФК. При выращивании штамма в среде с 20 г/л ТФК фиксировали наиболее высокую удельную скорость роста (0.04±0.002 ч^-1) и максимальное значение ОП 600 штамма (1.6), однако подготовительная фаза роста была более продолжительней, чем в среде с 10 г/л ТФК (рис. 1, таблица).

А                                      B

Рис. 1. Рост клеток штамма SA101 в среде с ОФК ( А ) и ТФК ( B ) (г/л): 1 – 1; 2 – 10; 3 – 20; 4 – 30 [Growth of strain SA101 on PA ( A ) and TPA ( B ) (g/l): 1 - 1; 2 - 10; 3 - 20; 4 – 30]

Наиболее высокий уровень утилизации фталатов был зарегистрирован при выращивании в среде с 10 г/л ОФК и ТФК (76% за 39 ч. и 74.2% за 71 ч. соответственно). Максимальная удельная скорость потреб- ления данных субстратов также наблюдалась при их концентрации 10 г/л: 0.052±0.006 ч-1 при культивировании на ОФК и 0.034±0.004 – на ТФК (рис. 2, таблица).

А

B

Рис. 2. Утилизация с использованием клеток штамма SA101 ОФК ( А ) и ТФК ( B ) в концентрации (г/л): 1 – 1; 2 – 10; 3 – 20; 4 – 30

[Utilization of PA ( A ) and TPA ( B ) by strain SA101 (g/L): 1 – 1; 2 – 10; 3 – 20; 4 – 30]

Параметры роста штамма SA101 и утилизация ОФК и ТФК [SA101 strain growth parameters and PA utilization and TPA]

Параметры	Ростовой субстрат, г/л
	ОФК			ТФК
	1	10	20	1	10	20
Удельная скорость роста, ч-1	0.038 ±0.003	0.073 ±0.003	0.070 ±0.004	0.028 ±0.001	0.03 ±0.002	0.04 ±0.002
Максимальное значение ОП 600	0.37	1.64	1.38	0.32	1.07	1.6
Лаг-фаза роста, ч	25	3	18	51	24	31
Утилизация, %	60.6 ± 0.4	76.0 ± 0.3	46.2 ± 0.4	55.5 ± 0.4	74.2 ± 0.4	57.2 ± 0.4
Удельная скорость утилизации, ч-1	0.040 ±0.003	0.052 ±0.006	.,020 ±0.001	0.027 ±0.003	0.034 ±0.004	0.010 ±0.002

Подавление роста бактерий высокими концентрациями фталевых кислот ранее показано для ряда штаммов разных родов, в том числе для Arthrobacter sp. 0574, способность которого к разложению ТФК подавлялась уже при концентрации 10 г/л и выше [Zhang et al., 2013]. Описан штамм Rhodococcus sp. N2, утилизирующий 10 г/л ТФК за 5 сут., а также штамм R. wratislaviensis КТ112-7, растущий в среде с ОФК в концентрации 8 г/л [Егорова и др. 2013; Suwanawat et al., 2019]. Ранее нами описаны бактерии рода Glutamicibacter , способные к росту и утилизации ТФК в концентрации до 30 г/л [Ястребова, Малышева, Плотникова, 2022]. Исследуемый штамм Paenarthrobacter sp. SA101 способен к эффективному разложению ОФК и ТФК за 23 и 71 ч. соответственно в концентрации до 20 г/л, что для представителей рода Paenar-throbacter показано впервые.

Исследование на наличие экстрахромосомной

ДНК модифицированным методом щелочного лизиса [Marko et al., 1982] показало присутствие в клетках Paenarthrobacter sp. SA101 плазмиды молекулярной массой ~100 т.п.н. (рис. 3). Плазмидная локализация генов деградации ОФК описана для штаммов Arthrobacter keyseri 12B и Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 [Eaton, 2001; Kallimanis et al., 2011]. Для ряда штаммов рода Paenarthrobacter показано наличие плазмид биодеградации аромати-

М    1     2

Рис. 3. Электрофореграмма плазмидной ДНК штамма Paenarthrobacter sp. SA101 (1). M – маркер O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (“Fermentas”, Литва); 2 – штамм-деструктор ТФК Rhodococcus sp.

S6 (плазмида ~100 т.п.н.)

[Electropherogram of plasmid DNA of Paenarthrobac-ter sp. SA101 (1). M - O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder marker (“Fermentas”, Lithuania); 2 – TPA destructor strain Rhodococcus sp. S6 (plasmid ~100 kb)]

ческих соединений. Так, у штаммов Paenarthrobacter nicotinovorans pAO1 и Paenarthrobacter sp. YJN-5 обнаружены плазмиды, включающие гены катаболизма никотина и ипродиона соответственно [Mihăşan et al., 2021; Zhang et al., 2021]. Можно предположить, что гены, контролирующие деструкцию ОФК и ТФК, у штамма SА101 также расположены на плазмиде.

Заключение

Таким образом, исследованный нами штамм Paenarthrobacter sp. SA101 способен к эффективному росту и утилизации до 20 г/л ОФК и ТФК, при этом в средах с ОФК зафиксированы более высокие параметры роста бактериальных клеток, чем в средах с ТФК: при использовании 20 г/л ТФК наблюдались наиболее высокие ростовые характеристики штамма, чем в среде с 10 г/л ТФК, однако подготовительная фаза роста была более продолжительней. Штамм SA101 способен к утилизации 76% ОФК в течение 39 ч. и 74.2% ТФК за 71 ч. культивирования при использовании данных фталевых кислот в концентрации 10 г/л. Штамм Paenarthrobacter sp. SA101 является перспективным для разработки биотехнологических методов очистки загрязненных фталатами почв и промышленных стоков.