Деструкция нефтяных углеводородов микрооганизмами рода Rhodococcus

Современные технологии нефтедобычи и транспортировки нефти и продуктов ее переработки приводят к значительному числу аварий, в результате которых в природные объекты попадает большое количество различных углеводородов. Эти ксенобиотики оказывают отрицательное воздействие на все компоненты экосистемы и в настоящее время считаются основными загрязнителями окружающей среды [1]. Особую нагрузку при этом испытывает почва, что проявляется в замедлении процесса минерализации, нарушении баланса почвенных ферментов, уменьшении дыхательной активности и способности к самоочищению, а также в снижении жизнедеятельности организмов почвенного биоценоза [2-3]. Использование биологических средств ликвидации нефтяных загрязнений почвы часто является единственно возможным способом восстановления экологически чистой обстановки. Биодеградация нефти в окружающей среде начинается микроорганизмами, поэтому важно, чтобы их численность была высокой (особенно на начальном этапе восстановления экосистемы). Это не всегда возможно, поскольку микробоценоз страдает от токсического шока, вызванного поступлением больших количеств нефти в случае разлива, и численность микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-деструкторов, способных использовать широкий круг органических экотоксикантов в качестве единственного источника углерода и энергии, позволяет ускорить разрушение нефти [4-5].

Подверженность углеводородов биоразложению зависит от их класса, концентрации в среде, разветвленности и длины углеродной цепочки, наличия в соединении галогенов, кислорода или других гетерогенных атомов. Кроме того, способность к окислению зависит от штамма микроорганизмов и условий их жизнедеятельности (аэрации, содержания СО 2 в воздухе и проч.). Степень деструкции углеводородов коррелирует с увеличением численности и оксигеназной активности бактерий. Микробное окисление

углеводородов нефти происходит через серию каталитических процессов с образованием промежуточных продуктов метаболизма – спиртов, альдегидов, кетонов, жирных и карбоновых кислот, которые в конечном итоге окисляются до углекислого газа.

На темпы биодеградации нефти и продуктов ее переработки влияет и обеспеченность алканотрофных бактерий микроэлементами, важнейшим среди которых является азот. При загрязнении почв нефтью вносится большое количество углерода, что приводит к резкому изменению соотношения C:N и установлению режима дефицита азота для углеводородокис-ляющих микроорганизмов. Поэтому задачей биотехнологического подхода к восстановлению почв является активизация микробного метаболизма путем корректировки углеродно-азотного баланса [6]. Как правило, это достигается путем внесения больших доз минеральных азотных удобрений, которые составляют одну из основных статей расходов при обезвреживании большинства загрязненных объектов. Такой способ является не только бесполезным, но часто и вредным, потому, что значительные количества удобрений могут быть токсичным для микроорганизмов и тем более для растений [7].

В то же время, в природных экосистемах баланс биогенных элементов поддерживается за счет биологической азотфиксации. До 90% количества азота в почве связано с деятельностью диазотрофных микроорганизмов. Поэтому внесение в загрязненную нефтью и нефтепродуктами почву полифункциональных штаммов бактерий, способных не только к деградации ксенобиотиков, но и к диазотрофии, представляется очень эффективным способом биоремедиации. Так, например, свободноживущие азотфиксаторы рода Ochrobactrum разлагают различные химические соединения, могут образовывать клубеньки на корнях растений и обладают денитрифицирующей активностью [8-11].

Целью данной работы было исследование способности штамма Ochrobactrum sp . ИБ ДТ-5.3/2 к окислению нефти, нефтепродуктов и органических соединений, а также к фиксации атмосферного азота, в т.ч. при пониженной температуре.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Окислительную активность штамма Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, изолированного из серой лесной поч- вы, загрязненной дизельным топливом [12] определяли по выделению углекислого газа. Для этого в среду Диановой-Ворошиловой [13] (250 мл) вносили 1% источника углерода и 5 мл трехсуточной культуры Och-robactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 с содержанием клеток 1,0∙108 КОЕ/мл. В герметично закрытые колбы подавали стерильный воздух (520 мл/мин), который после окисления субстрата улавливали поглотителем углекислого газа (200 мл 0,1н. гидроокиси натрия). Из сосудов посуточно отбирали аликвоту в количестве 10 мл и титровали 0,1н. раствором соляной кислоты. Окислительную активность рассчитывали по количеству углекислого газа, оттитрованного кислотой. Длительность эксперимента составляла 3 сут.

Определение нитрогеназной активности бактерий проводили методом, основанным на восстановлении ацетилена [14]. Микроорганизмы культивировали на безазотистой среде Эшби (50 мл) [13] при оптимальной температуре роста 26°C и в условиях пониженной температуры (8°C). Для проверки влияния источника углерода на азотфиксирующую активность, маннит в среде Эшби в других вариантах опыта был последовательно заменен на декан (0,5%), толуол (1%) и β-метилнафталин (0,5%). Активность фермента нитрогеназы определяли после двух суток выращивания микроорганизмов на лабораторной термостатируемой установке при 180 об/мин. Ацетилен вводили в сосуды с Ochrobactrum sp . ИБ ДТ-5.3/2 до концентрации 10% (по объему). Через 1,5 час отбирали шприцем пробы газа из каждой колбы в троекратной повторности.

Содержание ацетилена и этилена выявляли на газовом хроматографе «Кристалл Люкс 4000» (Россия) с пламенным ионизационным детектором (длина колонки 3 м, сорбент - Porapak Q) по времени выхода каждого газа, сравнивая его со временем выхода известного стандартного газа (азот). Объем вводимой газовой пробы 1 мл. Количество этилена и ацетилена рассчитывали по калибровочной кривой.

Титр бактериальных суспензий подсчитывали после двух суток культивирования на агаризованной питательной среде Раймонда [15] с 0,1% пептона. В качестве источника углерода на поверхность среды наносили 100 мкл стерильного дизельного топлива.

После отбора газовой пробы остаточное содержание декана и толуола определяли с помощью газовой хроматографии после экстракции гексаном, β-метилнафталина – гравиметрическим методом после экстракции хлороформом. Потенциальную активность азотфиксации в почве (чернозем выщелоченный) определяли по Умарову [16] с нашими модификациями. В почвенные образцы массой 200 г вносили по 10 мл бактериальной суспензии с титром 109 КОЕ/мл, увлажняли, тщательно перемешивали и убирали в термостат на 3 сут. Далее из каждого образца отбирали в пенициллиновые флаконы по 5 г почвы, добавляли по 2% (от массы абсолютно сухой почвы) источника углерода (маннит, декан, толуол и β-метилнафталин), увлажняли, перемешивали, герметично закупоривали резиновыми пробками (чтобы предотвратить улетучивание углеводородов). Часть проб помещали в термостат при 26оС, другую часть – в холодильник при 8оС. Через сутки во флаконы вводили по 0,5 мл аце- тилена. Еще через один час инкубации в термостате и холодильнике отбирали газовую пробу (0,5 мл) для анализа на газовом хроматографе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Штамм Ochrobactrum sp . ИБ ДТ-5.3/1 проявил высокую окислительную активность в отношении большинства использованных субстратов, за исключением парафина и церезина, что, скорее всего, объясняется нерастворимостью данных субстратов в воде (табл. 1). Постепенное возрастание способности к окислению в ряду н-алканов гептан-ундекан-додекан (77 – 94 – 116 мг СО 2 /г субстрата) вполне закономерно и объясняется увеличением биодоступности углеводородов по мере удлинения углеродной цепи.

Таблица 1. Окислительная активность микроорганизмов Ochrоbactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2

Субстрат	Окислительная активность, мг СО 2 /г субстрата
Гептан	77
Ундекан	94
Додекан	116
Циклогексан	99
Изопропанол	62
Гексадеканол	91
Фенол	36
Бензол	85
Толуол	93
о-Ксилол	76
Нафталин	88
Нефть	84
Дизельное топливо	60
Смазочное масло	99
Парафин	11
Церизин	14

От углеводородов с открытой цепью и циклоалканов ароматические углеводороды отличаются лучшей растворимостью в воде. Для их поступления в микробную клетку необязательно наличие гидрофобных внешних слоев. Они нарушают проницаемость мембран, блокируют действие ряда ферментов, т.е. представляют собой клеточные яды. Несмотря на высокую токсичность аренов и их производных, изучаемый штамм обладает значительной окислительной активностью по отношению к этим соединениям (76-93 мг СО2 /г субстрата), сопоставимой с таковой для предельных углеводородов. Нефть, смазочное масло, дизельное топливо также хорошо подвергаются микробиологическому окислению бактериями исследуемого штамма. Очевидно, что у микроорганизмов Ochrobac-trum sp. ИБ ДТ-5.3/1 имеется ферментная система оксидаз смешанных функций (оксигеназ), которые индуцируются продуктами последовательного окисления углеводородов: высшими жирными спиртами, альдегидами, кислотами. Оксигеназы осуществляют введение одного атома кислорода из его молекулярной формы в концевую метильную группу углеводорода, образуя при этом окисленные соединения. Это свойство является очень важным с практической точки зрения, т.к. благодаря ему бактерии Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 могут применяться в биотехнологии, например, в качестве основы биопрепарата для очист- ки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Далее была изучена нитрогеназная активность Ochrobactrum sp . ИБ ДТ-5.3/1 при различных температурах и источниках углерода, таких как маннит

(контроль), декан, толуол и β-метилнафталин, степень биодеградации этих углеводородов и динамика численности микроорганизмов в процессе эксперимента (табл. 2).

Таблица 2. Численность микроорганизмов штамма Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1, его нитрогеназная активность и степень биодеградации углеводородов, используемых в качестве источника углерода при выращивании на среде Эшби при температуре 8^оС и 25^оС

Субстрат	Титр, КОЕ/мл		Нитрогеназная активность, мкг N 2 /мл/ч		Биодеградация углеводородов, %
	8оС	26оС	8оС	26оС	8оС	26оС
Маннит	2,9 х 106	1,8 х 107	0,14	0,19	-	-
Декан	н/д	8,3 х 106	н/д	0,06	н/д	88,60
Толуол	9,6 х106	3,0 х 106	1,44	0,19	66,30	95,40
β-метилнафталин	3,0 х106	4,7 х 106	0,24	0,02	18,50	25,00

Прим. Начальный титр бактериальной суспензии при 8оС – 3,3х105 КОЕ/мл, при 25оС – 2,8х105 КОЕ/мл; «н/д» – нет данных

Рост численности микроорганизмов составил один порядок как при комнатной, так и при пониженной температуре, за исключением варианта, когда бактерии культивировали на среде Эшби с маннитом при 26^оС. В этом случае численность Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 увеличилась на два порядка.

При выращивании на среде с маннитом, нитрогеназная активность штамма при комнатной температуре (0,19 мкг N2 /мл/ч) незначительно увеличивалась по сравнению с таковой при низкой положительной температуре (0,14 мкг N2 /мл/ч). При использовании в качестве субстрата толуола способность к фиксации азота при 26оС осталась такой же, как в случае с маннитом (0,19 мкг N2 /мл/ч), а при 8оС – увеличилась до 1,44 мкг N2 /мл/ч. На среде с деканом и β-метилнафталином при комнатной температуре бактерии Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 проявляют очень низкую азотфиксирующую активность (0,06 и 0,02 мкг N2 /мл/ч, соответственно). При понижении темпе- ратуры до 8оС этот показатель резко возрастает в 12 раз при применении β-метилнафталина как источника углерода и энергии. В целом, можно отметить, что при использовании в качестве субстратов углеводородов нитрогеназная активность с понижением температуры возрастает. Возможно, это свидетельствует о наличии у Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 ванадийсодержащей нитрогеназы, способной к эффективной фиксации азота в условиях невысокой положительной температуры [17]. Происходящая в ходе азотфикса-ции бактериями деградация углеводородного субстрата, наоборот, увеличивалась с ростом температуры (табл. 2). Наиболее высокие показатели биодеструкции были достигнуты для толуола – 95, 40% при 26оС. Также достаточно полно разлагается при комнатных условиях и декан (88,60%). Эти значения хорошо соотносятся с данными по окислительной активности Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 в отношении как ароматических, так и предельных углеводородов (табл. 1).

Таблица 3. Потенциальная нитрогеназная активность почвенных образцов с аборигенной микрофлорой и инокулированных бактериями Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 при температуре 8^оС и 25^оС

Источник углерода	Потенциальная нитрогеназная активность почвы, мг N 2 /кг/ч
	8оС		26оС
	С аборигенными микроорганизмами	После инокуляции	С аборигенными микроорганизмами	После инокуляции
Маннит	1165	1303	990	2040
Декан	1016	2075	959	1852
Толуол	1074	2011	1173	5523
β-метилнафталин	950	2349	1646	2222

Потенциальная нитрогеназная активность почвенных проб с внесенными бактериями Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 как при 8^оС, так и при 26^оС была значительно выше, чем у контрольных образцов, содержащих только аборигенную микрофлору (табл. 3). Причем, при пониженной положительной температуре при использовании в качестве субстрата маннита, азотфиксирующая способность инокулированной почвы возрастала незначительно (в 1,12 раза), а при применении углеводородов различной химической природы азотфиксация увеличивалась в 1,87-2,47 раза (толуол и β-метилнафталин, соответственно). При

26оС самое высокое значение потенциальной нитрогеназной активности в контроле было у образцов с β-метилнафталином (1646 мг N2 /кг/ч), которое при ино-кулировании почвы Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 возросло в 1,35 раза (2222 мг N2 /кг/ч). При комнатной температуре наивысший показатель потенциальной нитрогеназной активности наблюдался у почвы, загрязненной толуолом - 5523 мг N2 /кг/ч (в контроле – 1173 мг N2 /кг/ч, увеличение в 4,71 раза). В случае с маннитом и деканом потенциальная нитрогеназная активность была схожей как у почвы с аборигенной микрофлорой (990 и 959 N2/кг/ч, соответственно), так и у проб с внесенными бактериями (2040 и 1852 N2 /кг/ч, соответственно). То есть, азотфиксирующая активность при инокуляции увеличивалась практически одинаково – в 1,93 раза у почвы с деканом и 2,06 раза у почвы с маннитом.

Таким образом, ферментные системы изучаемого штамма способны к окислению органических соединений различной природы, а также к фиксации атмосферного азота. Бактерии Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/1 обладают высоким биотехнологическим потенциалом. Они проявили себя как активные нефтедест-рукторы, разлагающие нефть и продукты ее переработки до конечных веществ - углекислого газа и воды. Одновременно с этим указанные микроорганизмы повышают плодородие очищаемой почвы, восполняя в ней недостаток важнейшего биогенного элемента – азота, в том числе при пониженной температуре.