Деструктивная активность и продукция внеклеточных пероксидаз у микромицетов с различной экологической стратегией

Загрязнение окружающей среды природными и техногенными поллютантами остается серьезной проблемой. На сельскохозяйственные угодья попадают такие масштабные и опасные поллютанты, как нефть и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ): нефть — из-за находящихся вблизи нефтедобывающих или нефтеперерабатывающих предприятий (1), ПАУ — в результате природных пожаров и человеческой дея-

Исследование выполнено при поддержке грантов РНФ ¹ 16-14-00081 (в части деградации ПАУ) и РФФИ ¹ 18-29-05062 (в части деградации нефти).

тельности, связанной с использованием горючего органического сырья (2). Это создает угрозу накопления токсичных веществ в кормовых и пищевых растениях. Природные экосистемы имеют мощный детоксикационный потенциал, который обеспечивается деструктивной активностью микроорганизмов, в том числе аскомицетов — одной из самых многочисленных групп царства грибов .

Виды рода Fusarium характеризуются высокой метаболической активностью и адаптационной пластичностью (3). В первую очередь они известны как наносящие вред сельскому хозяйству, вызывающие заболевания и токсикозы у растений и животных. Вид Fusarium oxysporum часто служит моделью для исследований взаимодействия растения с патогеном (4). Однако преобладающее число его представителей ведет сапротрофный образ жизни в почве, используя в качестве источников питания сложные углеводы и лигноцеллюлозу. Известны штаммы, образующие взаимовыгодный симбиоз с растениями и даже защищающие их от болезней (5, 6). Показано участие Fusarium в процессах деградации поллютантов, в том числе ПАУ и нефти (7, 8).

Грибы рода Cladosporium вносят значительный вклад в деградацию растительных остатков, но могут вызвать заболевания растений, порчу сена и зерна в хранилищах, выделяя опасные для животных и человека токсины. О деградации этими грибами поллютантов известно мало: С. resinae описан как креозотный, или керосиновый, гриб, корродирующий насосы; способность метаболизировать антрацен показана у C. herbarum (9), флуорантен — у C. sphaerospermum (10).

Представители родов Geotrichum и Lecanicillium заселяют другие типы биотопов. Geotrichum candidum вызывает различные гнили на органических субстратах, в том числе на плодах, и считается условно-патогенным грибом, возбудителем оппортунистических микозов. В то же время штаммы этого вида используют в производстве элитных сортов сыра и ряда кисломолочных продуктов (11). Данные о деградативных свойствах Geotrichum в основном касаются способности этого гриба обесцвечивать синтетические красители, в том числе содержащие конденсированные ароматические кольца (12, 13), трансформировать 2,4,6-тринитротолуол (14) и детергенты (15). Вид Lecanicillium aphanocladii (до 2001 года известный как Verticillium lecanii ) описан как энтомопатогенный (16, 17) и паразитирующий на других грибах (18). Его деградативные свойства в отношении поллютантов практически не исследованы. Имеются данные о представителях других видов этого рода: L. saksenae — деструкторе пестицидов (19), V. le-canii — деструкторе 2,4-дихлорфенола, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (20) и антрацена (9).

Деструкция природных веществ и ксенобиотиков у грибов осуществляется с помощью вне- и внутриклеточных ферментов. Внеклеточные лигнинолитические ферменты — лакказы и пероксидазы продуцируются многими видами базидио- и аскомицетов в процессе деградации лигноцеллюлозы и часто рассматриваются как ключевые ферменты деградации поллютантов (21). Сообщений о продукции подобных ферментов у L. aphano-cladii и C. herbarum мы не обнаружили.

Внутриклеточные ферменты, участвующие в деградации поллютантов, представлены в первую очередь цитохром P450-зависимыми монооксигеназами (цитохром P450-монооксигеназами), которые присутствуют в клетках грибов независимо от их способности продуцировать лигнинолитические внеклеточные ферменты. Предполагается, что путь первичного окисления ПАУ тем или иным ферментом зависит от ряда условий, при этом в случае 66

катализируемого цитохром P450-монооксигеназой гидроксилирования ароматического кольца и ряда последующих трансформаций могут образоваться эпоксиды и транс-дигидродиолы, которые являются мощными канцерогенами. В то же время опосредованное пероксидазой или лакказой окисление этих веществ происходит с образованием хинонов, которые далее метаболизируются грибом до соединений, которые менее токсичны, чем исходные ПАУ. Именно поэтому окисление ПАУ лигнинолитическими ферментами может быть более логичной стратегией для детоксикации загрязненной окружающей среды (22).

В этой связи представляет интерес оценить не только деструктивную активность ряда грибов-аскомицетов — постоянных и массовых обитателей фитоценозов, характеризующую их участие в самоочищении природной среды, но и определить наличие у них лигнинолитических ферментов, понижающих экологические риски, связанные с возможным образованием токсичных метаболитов.

В настоящей работе мы впервые показали способность ряда ранее не изученных штаммов аскомицетов различной родовой принадлежности активно разрушать нефть и ПАУ, продуцируя внеклеточные пероксидазы.

Нашей целью было изучение деградации нефти и полициклических ароматических углеводородов микромицетами с различной экологической стратегией, а также выявление лигнинолитических ферментов, участвующих в окислении этих поллютантов.

Методика. Использовали четыре штамма аскомицетов: Fusarium ox-ysporum IBPPM543 (выделен из старых шпал, пропитанных креозотом; IBPPM — Коллекция ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН), Lecanicillum aphanocladii IBPPM542 (выделен из спорокарпа базидиомицета Lentinus sp.), Clado-sporium herbarum MUT3238 и Geotrichum candidum MUT4803 (получены из Микотеки Туринского Университета — Mycotheca Universitatis Taurinensis, г. Турин, Италия).

Грибы культивировали в колбах в богатой среде для базидиомице-тов, содержащей NH 4 NO 3 — 0,724, KH 2 PO 4 — 1,0, MgSO 4 •7H 2 O — 1,0, KCl — 0,5, дрожжевой экстракт — 0,5, FeSO₄•7H₂O — 0,01, ZnSO₄•7H₂O — 0,0028, CaCl 2 •2H 2 O — 0,033, глюкоза — 10,0, пептон — 10,0 г/л, рН 6,0 (23). Из-за оптической непрозрачности этой среды для наблюдения за обесцвечиванием красителей использовали среду Кирка (24) в нашей модификации: KH 2 PO 4 — 2,0, MgSO 4 — 0,348, CaCl 2 •2H 2 O — 0,143, NH 4 NO 3 — 1,02 г/л; раствор микроэлементов — 10, тиамин — 0,5 мл/л. Раствор микроэлементов включал нитрилтриацетат — 1,5, MgSO₄•7H₂O — 3,0, MnSO 4 •H 2 O — 0,5, NaCl — 1,0, FeSO 4 •7H 2 O — 0,1, CoSO 4 — 0,1, CaCl 2 — 0,082, ZnSO 4 — 0,1, CuSO 4 •5H 2 O — 0,01, AlK(SO 4 ) 2 — 0,01, H 3 BO 4 — 0,01, NaMoO₄ — 0,01 г/л; рН 6,0 поддерживали 25 мМ фосфатным буфером. Источником углерода и энергии служила мальтоза в конечной концентрации 1 %.

Деградативную активность грибов оценивали по отношению к ПАУ (антрацен, фенантрен и флуорен), синтетическим красителям антрахинонового типа (Acid Blue 62 и Reactive Blue 4) и сырой нефти (содержание алканов — 47,4, нафтенов — 22,3, низкомолекулярных ароматических веществ — 4,4, высокомолекулярных ароматических веществ — 5,4, смол — 3,9, асфальтенов — 16,6 %). ПАУ и нефть вносили в среду культивирования в виде раствора в хлороформе, антрахиноновые красители — в виде водного раствора. Конечная концентрация для ПАУ и антрахиноновых красителей составляла 0,05 г/л, для нефти — 5,0 г/л. Среды засевали 2-су- точным инокулятом грибов и культивировали при температуре 26 °С и аэрации 120 об/мин, через 2 сут в колбы вносили поллютанты, в контрольные варианты — 100 мкл растворителя. Через 14 сут оценивали убыль поллютантов, содержание основных продуктов метаболизма и активность лигнинолитических ферментов.

ПАУ и продукты их деградации экстрагировали из культуральной жидкости хлороформом (трижды по 5 мл), экстракты объединяли, упаривали досуха и анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе GC-2010 («Shimadzu Deutschland GmbH», Германия) с пламенно-фотометрическим детектором. Вещества разделяли на колонке HP5 («Agilent Technologies Inc.», США), газ-носитель — гелий. Температуру колонки 200 °C поддерживали 3 мин, затем увеличивали до 270 °C со скоростью 15 °С/мин, и эту температуру поддерживали еще 2 мин. Перед проведением ГЖХ 2-карбоксибензальдегид, 2,2´-дифеновую и фталевую кислоты метилировали CH3COCl. Антрацен (время удерживания 4,15 мин), 9,10-антрахинон (5,39 мин), фенантрен (4,08 мин), фенан-трен-9,10-хинон (6,86 мин), флуорен (5,57 мин), 9-флуоренон (4,33 мин), 2-карбоксибензальдегид (7,31 мин), 2,2´-дифеновую кислоту (6,7 мин), фталевую кислоту (8,99 мин) использовали как маркерные соединения для идентификации ПАУ и продуктов их окисления.

Убыль красителей тестировали спектрофотометрически, отбирая из колб аликвоты (2 мл) через определенные промежутки времени с последующим измерением поглощения при X = 590 нм (25). Остаточную нефть из среды культивирования экстрагировали хлороформом (трижды по 5 мл), экстракты объединяли и упаривали досуха. Общее содержание нефти в образцах определяли адсорбционной хроматографией с гравиметрическим окончанием (26).

Активность ферментов оценивали спектофотометрически (Evolution 60, «Thermo Scientific», США): лакказу — по скорости окисления диаммо-ниевой соли 2,2´-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS) при X = 436 нм (27); Mn-пероксидазу — по скорости окисления 2,6-диметоксифенола в присутствии H2O2 и Mn2+ при X = 468 нм (28); лигнин-пероксидазу — по образованию продукта окисления вератрилового спирта при X = 310 нм (29). Пероксидазную активность рассчитывали как разницу между скоростью окисления субстратов в присутствии и без H2O2. За единицу активности (Ед/мл) принимали количество фермента, которое катализировало превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

Повторность во всех вариантах в экспериментах и анализах не менее чем 3-кратная, каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в программе Microsoft Excel 2003. На рисунках представлены средние значения ( M ) и стандартные отклонения (±SD).

Результаты. Исследованные грибы обладали нефтеокисляющей активностью. Во всех вариантах происходил интенсивный прирост биомассы, мицелий нарастал в виде пеллет разной величины, через 14 сут нефть была полностью эмульгирована. C. herbarum MUT 3238 и F. ox-ysporum IBPPM 543 разрушали нефть на 82, L. aphanocladii IBPPM 542 — на 60, G. candidum MUT4803 — на 46 %. В литературе представлено довольно много данных об участии микромицетов в деградации нефти (3033), однако отсутствуют публикации, в которых сообщалось бы о нефтеокисляющих свойствах L. aphanocladii .

В отношении ПАУ активность грибов различалась более выра-женно. Для C. herbarum убыль исходного количества антрацена, фенан-68

трена и флуорена из среды культивирования за 14 сут была практически полной. L. aphanocladii деградировал антрацен, фенантрен и флуорен соответственно на 40, 63 и 81 %. F. oxysporum окислял фенантрен и флуорен лишь на 20 и 40 %, G. candidum разрушал эти ПАУ не более чем на 18 %. Антрацен не подвергался деградации двумя последними грибами (рис. 1).

Поллютанты

Рис. 1. Деструктивная активность грибов Cladosporium herbarum MUT 3238 (А) , Fusarium ox-ysporum IBPPM 543 (Б) , Lecanicillium aphanocladii IBPPM 542 (В) , Geotrichum candidum MUT4803 (Г) (гистограмма) в отношении антрацена (1) , фенантрена (2) , флуорена (3) , Reactive Blue 4 (4) , Acid Blue 62 (5) , нефти (6) и продукция внеклеточных пероксидаз (график) (14-е сут; n = 3, указаны стандартные отклонения).

Ключевую роль в грибной деградации различных поллютантов приписывают внеклеточным окислительным ферментам, в первую очередь лигнинолитическим (21). В этой связи мы протестировали исследуемые штаммы на активность лакказы, лигнин- и Mn-пероксидазы. Для первичного скрининга грибов на продукцию этих ферментов часто используют их способность обесцвечивать антрахиноновые красители. Как показали тесты, все четыре аскомицета обладали этой способностью, что служило косвенным подтверждением наличия у них подобных ферментов. Однако в условиях нашего эксперимента активность лигнин-пероксидаз и лакказ у грибов мы не выявили. У трех штаммов (за исключением G. candidum ) присутствие поллютантов сопровождалось продукцией внеклеточных пероксидаз (см. рис. 1), которые в контрольных вариантах (без поллютанта) отсутствовали. Обнаружено, что их активность в значительной степени (до 40 %) стимулировалась ионами Mn²⁺, что делает эти ферменты подобными Mn-зависимым пероксидазам базидиомицетов (34).

По данным литературы, лигнинолитическими ферментами обладают многие микромицеты. Представители рода Fusarium продуцируют Mn-зависимую пероксидазу, лигнин-пероксидазу и лакказу, участвующие в реакциях стресса и деградации лигноцеллюлозы (35). Подтверждена роль лакказ в патогенезе грибов (36). Участие ферментов Fusarium в деградации ПАУ описано в различных вариантах. Например, в деградации антрацена и бенз(а)антрацена в загрязненных ПАУ мангровых осадках участвует лакказа F. solani, в то время как лигнин- и Mn-пероксидазу не детектировали (37). При использовании F. oxysporum для трансформации ароматических компонентов в сухих отходах оливковой мельницы обнаружена активность Mn-пероксидазы и Mn-независимой пероксидазы, а действие лакказы не выявлялось (38). У представителей вида G. candidum обнаружены три типа пероксидаз, участие которых в процессах деградации широко обсуждается. Это лигнин- и Mn-пероксидазы (39, 40), а также обесцвечивающая (dye-peroxidase) пероксидаза, которая, как предполагают, имеет узкий субстратный спектр и служит ключевым ферментом в деградации красителей, в том числе содержащих конденсированные ароматические кольца (12, 13). В нашем случае выявленная способность штамма G. candidum обесцвечивать антрахиноновые красители при очень низкой окислительной активности в отношении ПАУ позволяет предположить наличие у него именно внеклеточной обесцвечивающей (dye)-пероксидазы. В публикациях других авторов мы не обнаружили сведений о продукции лигнинолитических ферментов L. aphanocladii и C. herbarum.

Безусловно, в процессах жизнедеятельности грибов, в том числе в деградации поллютантов, участвуют и другие ферментные системы, в первую очередь оксигеназы, которые, как известно, являются внутриклеточными ферментами, и их участие связно с предварительным транспортом вещества в клетку. ПАУ обладают низкой растворимостью, что, вероятно, и определило слабую деградацию фенантрена и флуорена (18 %) у G. candidum .

luuuuu

Рис. 2. Хроматограммы экстрактов культуральной жидкости Cladosporium herbarum MUT 3238 после деградации антрацена (А) и флуорена (Б) : основные пики: ANTH — антрацен, ANTHQ — 9,10-антрахинон, FLU — флуорен, FLUQ — 9-флуоренон. Хроматограф GC-2010 («Shimadzu Deutschland GmbH», Германия) с пламенно-фотометрическим детектором, колонка HP5 («Agilent Technologies Inc.», США).

При исследовании продуктов окисления трехциклических ПАУ антрацена и флуорена грибом C. herbarum с помощью ГЖХ был выявлен метаболит деградации антрацена C. herbarum — 9,10-антрахинон (рис. 2), который через 14 сут практически полностью разрушался с образованием 2,2´-дифеновой и фталевой кислот. Метаболит деградации флуорена этим грибом — 9-флуоренол выявлялся в следовых количествах, что может быть следствием быстрой утилизации исходного ПАУ. В качестве одного из конечных продуктов деградации флуорена была обнаружена фталевая кислота, которая, как известно, включается у грибов в основной обмен (41).

При деградации флуорена грибом F. oxysporum наблюдалось образование и последующая утилизация 9-флуоренола, 9-флуоренона и 2-карбоксибензальдегида. Деградация ПАУ грибами C. herbarum и F. oxysporum происходила через образование и последующее разрушение хинонов, без накопления токсичных метаболитов. Следует отметить, что выявленные метаболиты были идентичны тем, которые мы обнаружили у базидио-мицетов (42, 43), что позволяет предположить наличие подобных метаболических путей деградации ПАУ и у аскомицетов.

При изучении метаболизма ПАУ грибами L. aphanocladii и G. can-didum таких однозначных результатов получить не удалось. В процессе деградации фенантрена L. aphanocladii были выявлены следовые количества фенантрен-9,10-хинона, которые исчезали с увеличением времени культивирования гриба. Обнаружение этого хинона и продукция штаммом Mn-пероксидазы позволяют предположить у L. aphanocladii сходный с C. herbarum и F. oxysporum путь разрушения ПАУ. Хиноновые метаболиты при деградации ПАУ G. candidum выявлены не были.

Рис. 3. Окисление полициклических ароматических углеводородов грубым ферментным препаратом пероксидазы Fusarium oxysporum IBPPM 543: PHE — фенантрен, ANTH — антрацен, FLU — флуорен, FLUQ — 9-флуоренон (2-е сут; n = 3, указаны стандартные отклонения).

Как упоминалось выше, три из четырех исследованных грибов продуцировали пероксидазу в ответ на присутствие в среде культивирования поллютантов. Известно, что лигнинолитические пероксидазы участвуют в деградации ПАУ, окисляя их с образованием соответствующих хинонов (21). Для выяснения роли обнаруженных Mn-пероксидаз аскомицетов в деградации ПАУ мы исследовали прямые реакции окисления трехциклических ПАУ ферментом из F. oxysporum. Нами был получен грубый препарат этого фермента, для чего грибной мицелий культивировали до достижения максимума продукции пероксидазы (20 Ед/мл), среду культивирования отделяли от мицелия фильтрованием, концентрировали в 50 раз ультрафильтрацией (фильтр Amicon PM-10, «Merck KGaA», Германия) и использовали как источник фермента. Обнаружено, что эта пероксидаза окисляла как нативные ПАУ флуорен и фенантрен, так и продукт окисления флуорена — 9-флуоренон (рис. 3). Следовательно, именно внеклеточная грибная пероксидаза окисляла ПАУ, а также, по меньшей мере, фракцию полиядер-ных ароматических соединений нефти. Важно отметить, что в условиях нашего эксперимента грибы с различной экологической стратегией проявляли сходные свойства. Все штаммы обладали высокой нефтеокисляющей активностью. Потенциально энтомопатогенный L. aphanocladii по деструктивным свойствам и продукции Mn-пероксидазы был подобен сапротро-фам C. herbarum и F. oxysporum. Существенно отличался от них условнопатогенный G. candidum, не проявивший значительной деструктивной активности в отношении ПАУ, что может быть следствием отсутствия у него внеклеточных пероксидаз, аналогичных лигнинолитическим, хотя в литературе этот вид упоминается как деструктор 2,4,6-тринитротолуола (14). У G. candidum окисление нефти и ПАУ, вероятно, обусловлено активностью других ферментов, например цитохром Р450-монооксигеназ (44).

Полученные нами результаты дают основания продолжить исследования, используя как классические биохимические методы выделения, очистки и всестороннего изучения ферментов и способов деградации поллютантов, так и современные молекулярно-биологические подходы, позволяющие установить наличие и экспрессию соответствующих генов.

Таким образом, представители двух широко распространенных в природе видов аскомицетов Cladosporium herbarum и Fusarium oxysporum , а также штамм менее известного и мало изученного вида Lecanicillium aphano-cladii обладают высоким деструктивным потенциалом в отношении нефти и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), что предполагает участие этих микромицетов в процессах самоочищения природных экосистем от поллютантов. Выявление лигнинолитических ферментов и соответствующих продуктов деградации ПАУ свидетельствует в пользу экологически целесообразного пути утилизации ПАУ (с образованием хинонов), что снижает негативные последствия, связанные с возможным образованием токсичных метаболитов. У штамма Geotrichum candidum лигнинолитические ферменты не обнаружены и окисление нефти и ПАУ могут выполнять другие ферменты, например цитохром Р450-монооксигеназы. Кроме того, велика вероятность наличия у этого штамма так называемой обесцвечивающей пероксидазы, имеющей узкий спектр субстратной специфичности и катализирующей обесцвечивание антрахиноновых красителей. Способность исследованных штаммов разрушать поллютанты делает их перспективными для практического использования в биоремедиацион-ных и других биотехнологических процессах.

Авторы благодарят профессора G.C. Varese (Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, г. Турин, Италия) за любезно пре доставленные ею штаммы грибов.