Детекция Chlamydia trachomatis в образцах крови как метод диагностики осложненных и персистирующих форм урогенитальной хламидийной инфекции

Федерации сохраняется неблагоприятной на протяжении многих лет, составив, например, в 2009 г. 80,3 случая на 100000 населения [2]. Урогенитальная хламидийная инфекция способна нанести серьезный вред репродуктивной системе как мужчин (орхит, эпидидимит), так и женщин (цервицит, воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), трубное бесплодие) [3, 4].

Значительный интерес ученых вызывают хронические формы УГХ, оказывающие существенное влияние на эпидемиологическую обстановку. Существование скрытых форм заболевания, протекающих без какой-либо клинической симптоматики, вероятно, свидетельствует о подавлении иммунного ответа при хронической хламидийной инфекции [5, 6]. При этом возбудитель не теряет своего патогенного потенциала и способности к размножению. В связи с этим хроническое течение УГХ так же опасно, как и выявление у пациента форм заболевания с клиническими симптомами, и требует полноценного лечения, профилактики и своевременной диагностики [5, 7, 8, 9].

Урогенитальная хламидийная инфекция, зачастую протекающая хронически, вызывает многочисленные осложнения, связанные с вероятной диссеминацией хламидий из первичного очага инфекции в другие органы. Это приводит к развитию серьезных заболеваний, таких, как мужское и женское бесплодие, болезнь Рейтера, перигепатит, офтальмо-хламидиоз, тазовый перитонит, патология беременности [8, 10, 11, 12]

Описано несколько путей распространения C. trachomatis в организме человека: интраканаликулярный (восходящий), лимфогенный и интранатальный (инфицирование новорожденного при прохождении родовых путей). Диссеминация возбудителя гематогенным путем с развитием экстрагенитальной патологии показана в работах отечественных исследователей [5–9].

Основанием для установления диагноза урогенитальной хламидийной инфекции является наличие клинической симптоматики и выявление C. trachomatis лабораторными тестами в клинических образцах. Однако в случаях со слабовыраженными клиническими признаками или при бессимптомном течении заболевания методы лабораторной диагностики становятся основным инструментом для верификации диагноза [13, 14].

В настоящее время для идентификации C. trachomatis оптимальным считается использование методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) [2, 15, 16]. В соответствии с протоколами Европейского руководства по ведению пациентов с инфекцией, вызванной C. trachomatis, и рекомендациями CDC, для обнаружения данного возбудителя предложена полимеразная цепная реакция (ПЦР), поскольку во многих исследованиях именно этот вариант МАНК продемонстрировал превосходство над другими лабораторными тестами, применяемыми для диагностики УГХ. Показаны высокая чувствительность и специфичность данной методики [17], ее применимость в лабораторной практике, высокая производительность, удобство интерпретации полученных результатов и относительно низкая стоимость анализа для пациента. Однако при хронических формах урогенитальной хламидийной инфекции и экстраге-нитальной локализации возбудителя исследование молекулярно-биологическими методами проб клинического материала из генитального тракта зачастую не позволяет идентифицировать C. trachomatis ввиду отсутствия генетического материала хламидий в данных отделах [5, 9].

В связи с этим представляется актуальной разработка лабораторных методов определения C. trachomatis в организме человека при хронической инфекции урогенитального тракта с учетом понимания механизмов диссеминации возбудителя.

Основной целью данной работы явилось изучение эффективности метода лабораторной диагностики, основанного на детекции C. trachomatis в клинических образцах из генитального и экстрагени-тального (кровь) сайтов, полученных от пациентов с УГХ в качестве материала для выявления специфической хламидийной ДНК методом ПЦР.

Материал и методы. По результатам обследования пациентов, обратившихся в Клинику кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» в период 2012–2014 гг., были отобраны 8 пациентов (4 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 25 до 44 лет (средний возраст составил 34,5 года). Критериями отбора явились: клинические признаки урогенитальной инфекции, профилактическое обследование на ИППП, половой контакт с больным УГХ, бесплодие.

Всем пациентам проведено клинико-лабораторное обследование: сбор анамнеза, физикальный осмотр, лабораторные исследования (бактериоскопия с целью определения Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis ; ПЦР для идентификации C. trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, вируса папилломы человека, вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов; метод ИФА для исключения сифилитической инфекции, вирусных гепатитов В и С, ВИЧ), а также инструментальное обследование (ультразвуковое сканирование мочеполовых органов).

Материалом для исследования служили клинические образцы — соскобы из уретры или цервикального канала, кровь. ДНК из соскобного материала изолировали методом нуклеосорбции с применением набора «ДНК-сорб-АМ» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия), из крови — набором DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) в соответствии с инструкцией. Наличие в материале специфической хламидийной ДНК определяли в ПЦР с последующим определением геновара хламидий по вариабельному региону VD2 гена omp1 C. trachomatis согласно рекомендациям [18]. Секвенирование специфических хламидийных ампликонов выполняли в компании «Евроген» (Москва, Россия). Расшифрованные нуклеотидные последовательности сравнивали с депонированными в генном банке последовательностями гена omp1 клинических изолятов C. trachomatis. Параллельно клинические образцы тестировали методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) с применением набора «Хлами-Скан» (БТК ЛАБдиагностика, Москва, Россия), специфические хламидийные антитела в сыворотках крови пациентов определяли коммерческим набором для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к C. trachomatis в иммуноферментном анализе (ТИФА) «ХламиБест-C. trachomatis-IgG» (ВекторБест, Новосибирск, Россия).

Результаты . Причиной для обращения за медицинской помощью явился один из факторов: наличие жалоб со стороны урогенитального тракта, профилактическое обследование на ИППП, выявление УГХ у полового партнера или направление гинеколога в связи с подготовкой к инвазивным манипуляциям ( в спомогательные р епродуктивные т ехнологии — ВРТ).

Анализ жалоб пациентов позволил определить субъективные проявления заболевания, такие как патологические выделения из половых путей, неприятный запах вагинального отделяемого, межменструальные и посткоитальные кровяные выделения, периодически возникающие боли внизу живота, в промежности и в яичках. Длительность заболевания составила от 3–4 недель до 12 месяцев.

При анализе анамнестических данных установлено, что у двух пациенток ранее регистрировались эрозия шейки матки и «вторичное бесплодие», у одной пациентки — односторонний сальпингоофорит, у двоих мужчин — хронический простатит и эпидидимит.

У обследованных пациентов средний возраст сексуального дебюта составил от 17,5 до 20,7 года. О регулярной половой жизни сообщили все восемь пациентов. После начала половой жизни и до проведения настоящего обследования пациенты имели от 1 до 15 половых партнеров.

При физикальном обследовании женщин отмечались следующие объективные клинические симптомы: в заднем своде влагалища скудные слизистые выделения, гиперемия слизистой оболочки шейки матки, слизистые или слизисто-гнойные выделения из цервикального канала. При бимануальном исследовании у двух пациенток отмечалось увеличение размеров яичников, умеренная болезненность при пальпации. По результатам УЗИ у двух пациенток были выявлены признаки ВЗОМТ.

При оценке локального статуса у мужчин зарегистрированы скудные слизистые выделения из наружного отверстия мочеиспускательного канала, гиперемия губок уретры. При проведении пальцевого ректального исследования отмечалось увеличение предстательной железы у двоих мужчин, болезненность при пальпации. Трансректальное ультразвуковое сканирование простаты свидетельствовало о наличии у данных мужчин признаков простатита.

Среди отобранных для исследования пациентов, по крайней мере, 62,5% отмечали ранее перенесенный УГХ, что в полной мере соотносится с выявленными у данных пациентов осложнениями в виде сальпингоофорита, хронического простатита, эпидидимита, бесплодия. Однако в сыворотках крови только 37,5% человек удалось обнаружить специфические «анамнестические» хламидийные антитела класса IgG (в титрах 1:8–1:40), считающиеся признаком перенесенной в прошлом хламидийной инфекции или хронического хламидиоза. По результатам лабораторного обследования методом ПИФ в уретральных и цервикальных соскобах в 87,5% случаев были выявлены бактерии C. trachomatis. Аналогичные данные были получены в ПЦР — в генитальных сайтах специфическая хламидийная ДНК детектировалась у тех же пациентов (87,5% соответственно). Вместе с тем применение того же варианта ПЦР позволило выявить возбудитель хламидиоза в крови в 100% случаев. Последующее генотипирование хламидийной ДНК, изолированной из генитального и экстрагенитальнго (кровь) сайтов инфекции, подтвердило наличие в указанных клинических образцах пациентов с УГХ генетического материала возбудителя трех (E, F и G) из восьми основных (D, E, F, G, H, I, J и K) сероваров C. trachomatis, известных как этиологические агенты УГХ у людей. При этом в генитальных сайтах несколько чаще (в 50% случаев) определялись хламидии гено-вара Е, в то время как ДНК хламидий двух других ге-новаров, F и G — в сходном количестве образцов из экстрагенитального сайта (образцы крови пациентов с УГХ) — по 25%, соответственно.

Обсуждение. На сегодняшний день УГХ остается актуальной проблемой практического здравоохранения вследствие высоких показателей заболеваемости и отсутствия тенденции к снижению выявления осложненных форм заболевания [1, 3, 4].

Современные клинические рекомендации регламентируют проведение исследований молекулярнобиологическими и культуральными методами для идентификации C. trachomatis в клинических образцах, полученных из мочеполового тракта [2, 13–16]. Однако практикующий врач может столкнуться с ситуацией, когда у пациента имеются отрицатель- ные результаты анализов на наличие возбудителей ИППП, взятых из генитальных сайтов, при явной манифестной клинической картине воспалительного заболевания мочеполовой сферы или выделении возбудителя УГХ у полового партнера [3, 17]. Кроме того, ряд диагностических манипуляций (забор биологического материала из урогенитального тракта, массаж предстательной железы, ТРУЗИ/ТВУЗИ) являются психологически дискомфортными для пациентов, а в некоторых случаях и крайне болезненными.

Как недавно было установлено, развитию хронической урогенитальной хламидийной инфекции способствует наличие у возбудителя адаптационных механизмов, приводящих к образованию персистирующих форм патогена. Данные варианты C. trachomatis в процессе эволюции приобрели способность противодействовать защитным действиям организма хозяина, что позволяет им длительно выживать в макроорганизме, вызывая и поддерживая воспаление, оказывая влияние на метаболические и биохимические процессы внутри клетки-мишени, приводя к развитию каскада иммунопатологических реакций [8]. Поэтому на первом этапе обследования пациентов нами был разработан следующий комплекс диагностических мероприятий с применением молекулярных и иммунодиагностических методов детекции C. trachomatis , который включал:

— выделение ДНК бактерии из образцов биологического материала (соскоб из уретры или шейки матки, кровь). Одновременно уретральные и цервикальные свабы тестировали методом ПИФ, а в сыворотке крови определяли специфические хламидийные антитела с помощью ТИФА;

— амплификацию и секвенирование гена omp1 ДНК вариантов C. trachomatis , выявленных в клинических образцах; гомологи расшифрованных нуклеотидных последовательностей исследуемого гена были обнаружены в базе данных GenBank.

Разработанный алгоритм диагностики различных форм урогенитальной хламидийной инфекции был апробирован на выборке из клинических образцов восьми пациентов с осложненными формами УГХ.

На первом этапе исследования получали хламидийную ДНК из образцов биологического материала (соскобы из уретры и цервикального канала, крови), положительных в ПЦР. Для контроля использовали метод ПИФ с моноклональными антителами с целью обнаружения специфического свечения в соскобном материале со слизистой уретры и шейки матки, а также определяли специфические хламидийные антитела в сыворотках крови пациентов для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к C. trachomatis в ТИФА с применением соответствующих коммерческих наборов.

В результате проведенного сравнительного анализа было установлено, что методом ПЦР в биологическом материале, взятом из экстрагенитального (кровь) сайта, C. trachomatis детектировалась у всех обследуемых (8/8, т.е. в 100% случаев), в то время как в клинических образцах, полученных из генитальных сайтов, у семи пациентов (только у 87,5%). Вероятно, в результате нарушения проницаемости эндотелия сосудов возбудитель УГХ мог проникнуть в кровеносное русло, где захватывался моноцитами, но не элиминировал из крови, а переходил в персистирующее состояние [5, 6]. Таким образом, сформировавшиеся атипичные элементарные тельца диссеминировали с током крови, причем их концентрация оказалась достаточной для детекции специфической ДНК C. trachomatis в ПЦР так же, как и у других ис- следователей [5–9]. В российских стандартах оказания медицинской помощи пациентам с УГХ [2], в рекомендациях Европейского IUSTI [14] и ВосточноЕвропейской сети репродуктивного здоровья [19] указывается на приоритет ПЦР, а также подчеркивается необходимость определения генотипов и вариантов C. trachomatis, так как для некоторых сероваров C. trachomatis (D, F, G, Ga, Ia) отмечены характерные особенности клинического течения хламидийной инфекции [20]. Причем в случае получения позитивных результатов МАНК, отсутствует необходимость проведения дополнительных исследований для подтверждения диагноза.

Методом ПИФ в отделяемом из уретры и шейки матки также у семи человек были выявлены бактерии C. trachomatis, что соответствует данным литературы о чувствительности и специфичности указанного метода [21, 22]. В сыворотках крови методом ТИФА только у трех человек были обнаружены специфические хламидийные антитела класса IgG, что показало относительно низкую прогностическую значимость данного метода диагностики. Видимо, поэтому серологические методы определения антител к C. trachomatis в США и ряде стран Европы исключены из стандартов современной лабораторной диагностики УГХ в связи с низкой диагностической ценностью. Однако данный метод применяется в диагностике венерической лимфогранулемы (определение высоких титров IgA и/или IgG-антител) и неонатальной пневмонии (детекция IgM) в педиатрической практике [22]. Хотя, с другой стороны, отсутствие детектируемых количеств специфических хламидийных антител может быть связано со способностью хламидий модулировать иммунный ответ макроорганизма [6] или же с генетической детерминированностью макроорганизма, обеспечивающей слабый иммунный ответ.

На следующем этапе определялся генотип клинических изолятов C. trachomatis . У пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией удалось выявить три геновара C. trachomatis — E, F и G, при этом геновар Е определялся в два раза чаще двух других геноваров, F и G. Анализ доступных источников научной литературы, касающихся молекулярнобиологических методов детекции C. trachomatis , показал преобладание геновара E, а также геноваров G и F, как наиболее распространенных в мире [23–25]. Существует предположение, что преобладание серо-варов E и G, вероятно, обусловлено их низкой иммунологической активностью [26].

На основании проведенных исследований нами разработан алгоритм обследования пациентов с различными формами воспалительных заболеваний мочеполовых органов хламидийной этиологии с наличием субъективной и/или объективной симптоматики. Помимо проведения стандартных анамнестических, клинических, инструментальных (УЗИ) и лабораторных (микроскопический, молекулярно-биологический) методов обследования, диагностический поиск был расширен за счет исследования образцов крови с целью детекции ДНК C. trachomatis . Использование данного алгоритма является перспективным для внедрения в практическое здравоохранение, что позволит повысить эффективность и качество современных лечебно-диагностических мероприятий, а также снизить финансовые затраты на обследование пациентов с различными формами урогенитальной хламидийной инфекции.

Заключение. В результате проведенных исследований достоверно установлено, что у пациентов с хроническими манифестными или бессимптомными формами урогенитальной хламидийной инфекции эффективность детекции ДНК C. trachomatis в экс-трагенитальном (кровь) сайте сопоставима и даже превышала частоту обнаружения генетического материала хламидий в генитальных сайтах. Данный метод является перспективным для выделения ДНК возбудителя УГХ независимо от локализации очага инфекции.

Критериями отбора для данного обследования могут служить:

• —    клинические признаки воспалительных заболеваний урогенитального тракта без лабораторного подтверждения наличия инфекционного агента в нижних отделах мочеполовой системы;

• —    бесплодие неустановленной этиологии;

• —    профилактическое обследование на ИППП, в том числе для прегравидарной подготовки.

В ходе выполнения работы также был установлен ряд геноваров C. trachomatis (E, F и G), которые могут играть важную роль в развитии осложнений со стороны урогенитального тракта (сальпингоофорит, простатит, орхит, эпидидимит, бесплодие) хламидийной этиологии.

Дифференцированный подход в ведении пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией определяет выбор комплекса диагностических мероприятий, включающего в себя исследования клинических образцов из генитального и экстрагенитального (кровь) сайтов, что повышает эффективность обнаружения C. trachomatis у больных с осложненными и персистирующими формами урогенитальной хламидийной инфекции, особенно в случаях затруднения выявления хламидий в клиническом материале пациентов, полученном из генитальных сайтов.