Диагностика острых отравлений алимемазином методом ГХ/МС при проведении химико-токсикологических исследований биологических жидкостей лабораторных животных

Алимемазин (торговое название «Терали-джен», «Терален») – антипсихотическое средство, производное фенотиазина, применяющееся для лечения заболеваний нервной системы. В связи с довольно распространенным назначением данного лекарственного препарата участились случаи передозировок им. При анализе данных литературы установлено большое число отравлений алимемазином, в том числе с летальным исходом [4– 8]. Клиническими проявлениями отравлений являются следующие признаки: экстрапирамидные расстройства (тремор, акатизия), повышение судо- рожной активности (у детей), снижение артериального давления, тахикардия. Симптомы интоксикаций, характерные для алимемазина, имеют довольно схожую клиническую картину отравлений с другими лекарственными препаратами, поэтому для точной постановки диагноза необходимо проведение химико-токсикологического анализа не только по содержанию основного вещества, но и его метаболитам.

В работах зарубежных авторов описаны некоторые основные метаболиты алимемазина: 3-гидрокситримепразин (m/z 314), N – деметил-тримепразин (m/z 284), N-деметил-3-гидрокситри- мепразин (m/z 300) и сульфоксид тримепразина (m/z 314) [9].

В моче после кислотного гидролиза обнаружены шесть метаболитов алимемазина с молекулярными массами 199, 257, 356, 326, 312, 384 а. е. м., большинство из них были ацетилированными продуктами [10].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать способы обнаружения али-мемазина и его основных метаболитов в биологических жидкостях с помощью метода ГХ/МС для установления факта острого отравления.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Для осуществления экспериментального исследования использовали суспензию из таблеток «Тералиджен» с дозировкой действующего вещества – 5 мг (производство: Фармацевтическое Акционерное общество «Хаузянг», Вьетнам), стандартные образцы субстанции алимемазина (Sigma – Aldrich, каталожный номер 32113 – 10 MG) и основных метаболитов: 3-гидрокситри-мепразин (LGC Standards, каталожный номер TLCI-113-10MG) , N-диметилтримепразин (LGC Standards, каталожный номер TLC-E-207-10MG), N-диметил-3-гидрокситримепразин (LGC Standards, каталожный номер TLCT-711-10MG), сульфоксид тримепразина (LGC Standards, каталожный номер TLC-697-10MG) .

Исследование проводили на крысах обоего пола линии Wistar средней массой 200 г. Животным с помощью зонда перорально вводили суспензию алимемазина с терапевтической и токсической концентрацией действующего вещества [2]. Параллельно был проведен контрольный опыт. После чего, через различные промежутки времени (15, 30 минут, 1, 2, 3 часа), животных вводили в наркоз, декапитировали и осуществляли у них забор плазмы крови. Сбор мочи проводили в тех же временных интервалах. Контрольной группе животных али-мемазин не вводили.

Для изолирования алимемазина из мочи и плазмы крови использовали описанные ранее методики [2] с учетом факторов экстрации [3].

Обнаружение алимемазина и его метаболитов проводили методом ТСХ. Растворы извлечений из мочи и плазмы крови, а также раствор стандартного образца алимемазина наносили на хроматографическую пластину «Сорбфил».

Процесс разделения веществ осуществляли с использованием ранее выбранной системы: 25%-й раствор аммиака – этанол (1 : 1) – этилацетат – ацетон (4 : 90 : 45) [1]. Детектирование проводили УФ-светом. Неидентифицированные пятна элюировали с пластины в 96%-м спирте и анализировали методом ГХ/МС.

Анализ полученных извлечений методом ГХ/МС проводили на газовом хроматографе Maestro 7820 с масс-спектрометрическим детектором Agilent 5973 N.

Работа была осуществлена на базе химикотоксикологической лаборатории ГБУЗ «Наркологический диспансер» МЗ Краснодарского края (табл. 1). Ввод пробы проводился автоматически.

Работа масс-селективного детектора проводилась в режиме электронного удара (70 эВ). Сигнал регистрировали по полному ионному току. Диапазон масс-сканируемых ионов 40– 540 а. е. м.

Идентификацию веществ осуществляли по характерным временам удерживания и совпадению масс-спектров веществ с библиотечными и со стандартными образцами.

Таблица 1

Хроматографические условия

Показатель	Условия
Колонка	Кварцевая капиллярная HP–5–1-MS длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм
Температурная программа колонки	Начальная температура колонки 90 ° С, далее подъем температуры со скоростью 15 ° С/мин до 280 ° С
Газ-носитель	Гелий
Скорость потока газа-носителя	1,10 мл/мин с задержкой на растворитель в 3 мин
Температура инжектора	260 ° С
Температура детектора	280 ° С
Скорость потока: воздуха водорода поддувочного газа	400 мл/мин 40 мл/мин 30 мл/мин
Объем вводимой пробы	1 мкл

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении анализа методом ТСХ на хроматографических пластинах, помимо пятен основного вещества, наблюдались дополнительные пятна, которые были исследованы. Для этого нами была проведено снятие слоя силикагеля с дополнительного пятна. После чего его растворяли в 96%-м спирте, полученный раствор подвергали фильтрованию через бумажный фильтр «синяя лента». Подтверждение присутствия алимемазина в извлечениях из мочи и плазмы проводили методом ГХ/МС.

Полученные хроматограммы представлены на рис. 1–3.

На полученных хроматограммах имеется пик большой интенсивности со временем удерживания 13,52 минуты, который совпадает по времени удерживания с пиком алимемазина в растворе стандартного образца.

Масс-спектры извлечений из мочи и плазмы представлены на рис. 4–6.

Рис. 1. Хроматограмма извлечения из мочи с терапевтической дозой алимемазина (3 часа)

Рис. 2. Хроматограмма извлечения из плазмы с терапевтической дозой алимемазина (2 часа)

Рис. 3. Хроматограмма извлечения из плазмы с токсической дозой алимемазина (1 час)

Ion 298.00 (297.70 to 298.70): 9

Ion 198.00 (197.70 to

429.8

J| 452.1 479.1 503.1 530.2

i 'і'¹] I i¹¹¹!¹ I I I I I 'і I і ‘5'Л i"| I ‘і¹ 1 I I 'і I I I [■■; ■ I ^hi f ] I

420 440 460 480 500 520 540

Рис. 4. Масс-спектр извлечения из мочи с терапевтической дозой алимемазина (3 часа)

Рис. 5. Масс-спектр извлечения из плазмы с терапевтической дозой алимемазина (2 часа)

220000-     58.о

alimemazine

Рис. 6. Масс-спектр извлечения из плазмы с токсической дозой алимемазина (1 час)

326.9349 3 377.1   415.2439.0 467.1489.2 519.0

'I l‘'l"l Г|ТГ I 'I | I T Гі''|'ГГГТ”|"1^,"| 'I ’l'] I ГІ I'| I I IT| ГІЧ I"] Г Г I Г | I I I I 'I TT1.....ГТІ I £0 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

На масс-спектрах извлечений присутствовал выраженный пик молекулярного иона али-мемазина (m/z 298).

Максимальное количество алимемазина в извлечении из плазмы крови обнаруживалось через 2 часа после введения лабораторным животным суспензии с терапевтической дозой али-мемазина и через 1 час – при введении токсической дозы. В моче лабораторных животных максимальная концентрация алимемазина наблюдалась спустя 3 часа после перорального введения суспензии алимемазина.

Далее в масс-спектрах извлечений из плазмы и мочи были выделены все не идентифицированные молекулярные ионы. На основании возможных реакций метаболизма нами идентифицированы предполагаемые метаболиты по их молекулярным ионам. Идентификация веществ с одинаковыми молекулярными ионами сопоставлена со структурой по дефрагментации молекулярного иона.

В результате анализа нами была установлена структура 7 метаболитов в извлечениях из мочи и плазмы лабораторных животных. Таким образом, можно предположить следующие пути метаболизма алимемазина: деметилирование молекулы алимемазина, в результате которого образуется ион m/z 255 (М1), далее происходит ряд реакций деметилирования, в ходе которых образуется метаболит М2 (m/z 199). Одним из возможных путей метаболизма является окисление атома серы с образованием метаболита М3 (m/z 314).

Возможно также образование метаболита М 4 в результате реакции гидроксилирования с формированием 3-гидроксиалимемазина с Мr 314 г/моль. Также возможно образование конъюгатов с уксусной кислотой: М 5 (m/z 326), М 6 (m/z 357), М 7 (m/z 385).

Обнаруженные метаболиты проявляются в биологических жидкостях в различные промежутки времени (табл. 2).

Таблица 2

Идентификация метаболитов алимемазина в моче и плазме в зависимости от времени

Время обнаружения	Характеристический ион	Полученные данные	Данные литературы
1	2	3	4
Моча с терапевтической дозой алимемазина
30 минут	m/z 312,8	М 3/М4	М 3/М4 [6,11]
	m/z 252,9	М 1	М 1[11]
1 час	m/z 327,7	М 5	М 5 [11]
	m/z 357,3	М 6	М 6 [11]
	m/z 382,9	М 7	М 7 [6,11]
3 часа	m/z 313	М 3/М4	М 3/М4 [6,11]
	m/z 384,9	М 7	М 7 [6,11]
	m/z 253,9	М 1	М 1 [11]
Плазма с терапевтической дозой алимемазина
15 минут	m/z 324,9	М 5	М 5 [11]
30 минут	m/z 198	М 1	М 1 [11]
1 час	m/z 253	М 1	М 1[11]
2 часа	m/z 198	М 2	М 2 [11]
	m/z 326,9	М 5	М 5 [11]
Плазма с токсической дозой алимемазина
15 минут	m/z 198	М 2	М 2 [11]
30 минут	m/z 198	М 2	М 2 [11]
	m/z 326,9	М 5	М 5 [11]
	m/z 355,8	М 6	М 6 [11]
1 час	m/z 198,1	М 2	М 2 [11]
	m/z 356,9	М 6	М 6 [11]
2 часа	m/z 198,1	М 2	М 2 [11]
3 часа	m/z 198,1	М 2	М 2 [11]

Таким образом, в извлечениях из мочи и плазмы с терапевтической концентрацией али-мемазина идентифицированы все описанные выше метаболиты, в плазме с токсической концентрацией – метаболиты М 2 , М 5 , М 6 . Достоверное подтверждение острого отравления алимемазином можно доказать по отсутствию в извлечении из плазмы крови метаболитов М 1, М 3 , М 4 , М 7 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана методика обнаружения али-мемазина и его метаболитов в биологических жидкостях (моча, плазма крови) лабораторных животных, проведен анализ полученных извлечений методом ГХ/МС.

Данная методика анализа рекомендована для экспресс-диагностики отравлений алиме-мазином.