Диагностика возбудителя кольцевой гнили в клубнях картофеля методом полимеразной цепной реакции

Картофель - уникальная сельскохозяйственная культура, используемая для продовольственных и кормовых целей. Расчетная потенциальная продуктивность картофеля в оптимальных условиях может достигать 60-100 т/га. Однако картофель восприимчив к возбудителям вирусных, грибных и бактериальных болезней, что связано, прежде всего, с его вегетативным размножением клубнями. Поэтому важным резервом увеличения производства этой культуры является планомерная борьба с болезнями, потери от которых в последние годы составляют более четверти полученного урожая.

Бактериальная кольцевая гниль картофеля -широко распространенное заболевание, наносящее серьезный экономический ущерб семеноводству и сельскому хозяйству многих стран мира (Easton G.D., 1979). Оно распространено во всех странах северного полушария, но особенно вредоносно в странах Балтии, Белоруссии, европейской части России, Полесских и лесостепных районах Украины, на Востоке и Дальнем Востоке. Возбудитель данного заболевания Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) является объектом международного карантинного контроля и включен в список А2 Европейской организации по защите растений.

Основными симптомами заболевания является вилт (увядание) надземной части растения и кольцевая гниль клубней (рис. 1, рис. 2).

Диагноз кольцевой гнили обычно ставится при обнаружении этих признаков болезни и биотестом на баклажане, альтернативном растении-хозяине Cms . Однако эти методы не позволяют обнаружить латентный период течения болезни, во время которого визуально определить заболевание невозможно.

Наличие латентной (скрытой) формы инфекции, в течение которой растения не имеют явно выраженных симптомов, а инфицированные клубни визуально не отличаются от здоровых, способствует быстрому и незаметному распространению патогена и наносит экономический ущерб.

Эффективный контроль заболевания с использованием молекулярно-генетических методов диагностики позволит определить наличие возбудителя кольцевой гнили картофеля независимо от формы заболевания. На сегодняшний день одним из ключевых методов идентификации патогенов и диагностики инфекционных заболеваний у растительных и животных организмов является полимеразная цепная реакция.

Цель нашей работы – определить наличие патогена Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в клубнях картофеля методом полимеразной цепной реакции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для работы использовали культуру бактерий возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (штамм 5369, вирулентный, мукоидный), которую выращивали в течение двух суток, при температуре 25 ° С на жидкой или агаризованной среде C (Meletzus D. and Eichenlaub R., 1991). Экстракцию ДНК бактерий осуществляли по методу быстрого выделения ДНК из грам-положительных бактерий (Pospiech A. and Neumann B., 1995).

Стерильные клубни были получены из пробирочных растений картофеля (сорта -Луговской, Лукъяновский). Часть клубней была инокулирована суспензией бактерий Cms (штамм 5369, титр инокулюма 1×10⁸, период инкубации 3,5 месяца). Также в работе использовали клубни картофеля, выращенные в условиях фитотрона и в поле. ДНК из клубней картофеля выделяли по методу быстрой экстракции ДНК бактерий из зараженных клубней (Niepold F., 1999).

Диагностику Cms в клубнях картофеля осуществляли по методу определения Cms в зараженных клунях с помощью ПЦР (Pastrik K.H., 2000), c некоторыми модификациями. Для проведения амплификации использовали праймеры к нуклеотидной последовательности межгенного спейсера 16S-23S pРНК, синтезированные СИНТОЛ: PSA-F (5'-ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa-3') и PSA-R (5'-tac tga gat gtt tca ctt ccc c-3‘).

Реакционную смесь объемом 50 мкл, состоящую из 2 фаз и воска (15 мкл) для их разделения, готовили в микропробирках для ПЦР, поочередно добавляя реактивы. Нижняя фаза содержала 3 мкл Н 2 О, 5 мкл дНТП и по 1 мкл каждого праймера; верхняя – 10 мкл ПЦР-буфера (5 x ), 7 мкл Н 2 О, 2,5 мкл MgSO 4 , 0,5 мкл Taq-полимеразы. На поверхность ПЦР-смеси наносили 15 мкл Н 2 О и 5 мкл исследуемой ДНК, после чего пробирки помещали в амплификатор (БИС, модель-109).

Протокол амплификации включал: 1 цикл продолжительностью 3 мин при температуре 95 ° С; 10 циклов при 95 ° С в течение 1мин, 64 ° С -1мин, 72 ° С - 1мин; 25 циклов при 95 ° С - 30 с, 62 ° С - 30 с, 72 ° С - 1мин. После последнего цикла реакционную смесь выдерживали при 72 ° С в течение 5 мин и в последующем хранили при температуре 4 ° С.

Для разделения ПЦР-продуктов проводили электрофорез в 1,5 % агарозном геле. Для визуализации ДНК гель в течение 25 мин инкубировали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолете на приборе Gel Doc XR ("Bio Rad").

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно нашим наблюдениям, инфицированные клубни картофеля спустя 3,5 месяца после инокуляции суспензией бактерий Cms штамм 5369 визуально не отличались от здоровых клубней (рис. 3).

Рис. 1. Хлороз и некроз листьев, вилт надземной части картофеля.

Рис. 2. Гниль по сосудистому кольцу клубней.

Рис. 3 . Клубни картофеля сорта Лукъяновский:

А – неинфицированный клубень,

Б – клубень, инфицированный бактерией Cms (штамм 5369).

Период инкубации 3,5 месяца.

Рис. 4 . Результаты ПЦР анализа ДНК из клубней картофеля сорта Лукъяновский.

Стрелкой отмечены фрагменты ДНК размером 502 п.о.

1 – маркер молекулярного веса ДНК (100-1000 и1500 п.о.);

2-4 – отрицательный контроль (стерильные клубни in vitro );

5 – положительный контроль (бактерии Cms штамм 5369)

6 – клубни, искусственно инфицированные Cms штамм 5369

7 – клубни, выращенные в полевых условиях

Полученные результаты согласуются с литературными данными о наличии у бактериальной кольцевой гнили латентной (скрытой) формы инфекции, во время которой стебли и клубни растения не имеют выраженных признаков болезни. Однако при благоприятных для инфекции условиях, латентная форма может развиться в заболевание со всеми характерными для него симптомами: вилт надземной части растений и гниение клубней картофеля.

Поэтому молекулярно-генетические подходы в диагностике латентных инфекций, с помощью которых идентифицируют ДНК патогена в клубнях, должны иметь явные преимущества по сравнению с методами, которые основываются на визуальном осмотре клубней при отборе посадочного материала.

В настоящей работе для выделения ДНК использовали бактериальную культуру Cms штамм 5369, стерильные клубни пробирочных растений картофеля, клубни, искусственно зараженные суспензией бактерий Cms штамм 5369, а также клубни, взятые с поля.

ПЦР анализ ДНК бактерий штамма 5369 с праймерами PSA-F и PSA-R выявил у бактерий фрагмент ДНК ожидаемого размера – 502 п.о. (рис. 4).

Полученные результаты подтвердили видовую принадлежность бактерий штамма 5369 как Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus (Cms). При амплификации ДНК, выделенных из искусственно зараженного картофеля и ДНК из клубней, взятых с поля, были выявлены ПЦР-продукты того же размера (502 п.о.), что и при амплификации ДНК бактерий Cms . Таким образом, было установлено наличие инфекции в искусственно зараженных клубнях и в клубнях с поля и определена их идентичность бактериям Cms штамма 5369.

В настоящее время полимеразная цепная реакция является наиболее точным и чувствительным диагностическим методом, позволяющим быстро выявлять латентную инфекцию различных фитопатогенов, в том числе бактерий Cms , вызывающих кольцевую гниль картофеля.