Дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы с использованием молекулярно-генетического метода

Рак щитовидной железы (РЩЖ) является самым распространенным заболеванием эндокринной системы и имеет тенденцию к увеличению во всех странах мира. По оценкам зарубежных экспертов, при сохранении текущих темпов прироста заболеваемости РЩЖ уже к 2020 г. станет самой распространенной опухолью у женщин. В РФ прирост абсолютного числа заболевших РЩЖ в период с 2004 по 2014 гг. составил 36,5% у женщин и 15,5% — у мужчин, оба пола — 18,5%.

От всех злокачественных опухолей на долю РЩЖ приходится около 0,5–1% мужского населения и 1–4,4% — женского. РЩЖ встречается в 3 раза чаще у женщин, чем у мужчин, и обычно представлен в виде узловых образований, которые выявляются (по различным данным)

у от 4 до 40% населения. По данным ВОЗ за последние 20 лет заболеваемость РЩЖ в странах Европы и США удвоилась, главным образом, за счет лиц молодого и среднего возраста [1].

Основным неинвазивным методом диагностики узловых образований является ультразвуковое исследование (УЗИ) ЩЖ. С помощью УЗИ определяются подозрительные эхографические признаки опухолевого поражения ЩЖ. Подозрительными признаками являются (оценивают только в солидных узлах или в солидных участках узлов): гипоэхогенная солидная структура, неровный, нечеткий или полициклический контур точечные гиперэхогенные включения (микро-кальцинаты), преобладание высоты узла над шириной

(«выше,чем шире»), увеличенные лимфоузлы шеи [2].

В зависимости от количества подозрительных эхографических признаков, позволяющих предположить злокачественность или доброкачественность узла ЩЖ система TI-RADS (от англ. Thyroid Imaging Reporting and Data System), предложенная в 2009 г. E. Horvath и соавт. и модифицированная в 2011 г. J.Y. Kwak, определяет риск РЩЖ [3].

TI-RADS 1 — пациенты с неизменённой паренхимой. TI-RADS 2 отсутствуют признаки злокачественности (это коллоидные кисты ЩЖ, губчатые кисты, кисты с пристеночным компонентом) — 0–4%. TI-RADS 3 — отсутствие признаков злокачественности, но с наличием изо- или гиперэхогенных узлов с эксцентрично-расположенными анэхогенными включениями) — менее 5%; TI-RADS 4a — наличие одного признака злокачественности: 5–10%; TI-RADS 4b — двух признаков и более, но отсутствием регионарной лимфаденопатии — 10–80%; TI-RADS 5 — наличие трёх-пяти признаков или выявленным метастатическим поражением зон регионарного лимфооттока- более 80%. Однако, данная методика носит субъективный характер и сильно зависит от квалификации врача ультразвуковой диагностики и разрешающей способности УЗ-аппарата.

Основным методом дооперационной диагностики узлов ЩЖ является тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия (ТАПБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием полученных препаратов [2]. Специалисты цитологической диагностики во всем мире в настоящее время используют классификацию поражений ЩЖ по системе Bethesda (Bethesda Reporting System for Thyroid FNA Cytology,USA 2009 г.) [5]. В этой классификации выделяют 6 основных диагностических категорий, и, при этом, специалисты присваивают каждой категории так называемый риск злокачественности, т.е. в каком проценте случаев при постановке того или иного цитологического диагноза гистологически выявляется злокачественная опухоль. I. Недиагностический материал (кровь, артефакты, клеточный состав скудный или отсутствует, содержимое кисты) 1–4%.

• II.    Доброкачественные изменения (коллоидный узел, аутоиммунный тиреоидит, токсический зоб) 0–3%.

• III.    Атипия неясного значения 5–15%.

• IV.    Фолликулярная неоплазия или подозрение на фолликулярную неоплазию (в том числе из клеток Гюртля) 15–30%.

• V.    Подозрение на рак (папиллярный, медуллярный, низкодифференцированный) 60–75%.

• VI.    Рак (папиллярный, медуллярный, низкодифференцированный, лимфома и т.д.) 97–99%.

По различным оценкам, ТАПБ в 15–30% случаев не может дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли ЩЖ. В этих случаях заключения по цитологическому исследованию формулируются как

«фолликулярная неоплазия», «фолликулярная опухоль» или «новообразование ЩЖ», которые представляют собой гетерогенную группу так называемых «неопределенных» изменений — как злокачественных, так и доброкачественных заболеваний, имеющих сходную цитоморфологическую картину. Только 10–15% из них при гистологическом исследовании действительно оказываются злокачественными [4].

Принадлежность образца к первой категории вообще не позволяет выставить диагноз при цитологическом исследовании. Доля неинформативных пункций составляет в разных медицинских учреждениях 5–12% [6].

Кроме того, даже при адекватном заборе материала, до 30% случаев заключение оказывается неопределенным, поскольку цитологических признаков оказывается недостаточно для разделения доброкачественных и злокачественных опухолей.

Метаанализ, проведенный M. Bongiovanni и соавт. (2012), показал, что частота «неопределенного» цитологического заключения может достигать 20–30% [7].

Согласно классификации Bethesda (Национальный институт рака, США) выделяют 3 типа цитологических «неопределенных» диагнозов: Bethesda III, IV, V. Одной из причин относительно большого количества ошибочных диагнозов фолликулярных опухолей является также отсутствие объективных критериев дифференциальной диагностики. Единственным доказательством высокодифференцированного фолликулярного рака является обнаружение инвазии опухоли в сосуды и капсулу, что невозможно обнаружить при цитологическом исследовании.

В случае атипии неясного генеза риск злокачественности оценивается от 5 до 15% и рекомендуется повторная ТАБ. Риск злокачественности при Bethesda IV повышается до 15–30%, а при Bethesda V — до 60–75%.

Таким образом, существует необходимость совершенствования методов диагностики, в частности использование молекулярных маркеров злокачественности.

В качестве молекулярных маркеров РЩЖ могут выступать соматические онкоспецифичные изменения в геноме клеток ЩЖ (точечные мутации в генах BRAF и изоформ гена RAS, перестройки генов RET/PTC, PAX8/ PPAR γ и др.), наборы микроРНК с указанием значимых изменений их концентраций, а также изменение экспрессии некоторых белок-кодирующих генов и иммуногистохимический анализ содержания их продуктов [8–11].

В настоящий момент в мировой практике для дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ существует лишь один нормативный документ, рекомендующий применение молекулярно-генетических методов: American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Diffentiated Thyroid Cancer в 2017г опубликована Bethesda Reporting System for Thyroid FNA Cytology II, содержащая обоснования и рекомендации применения молекулярно-генетических методов исследования в группах III, IV и V [12].

Катанян Г.А., Дурлештер В.М., Измайлова Л.Г. и др. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА УЗЛОВЫХ ОБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА

Цель работы : сравнительная оценка информативности применяемых в практике методов диагностики узловых образований ЩЖ, включая молекулярно-генетический метод исследования.

Материал и методы

Ретроспективному анализу подвергнуты результаты обследования и лечения 61 пациента отделения эндокринной хирургии ГБУЗ ККБ №2, оперированных по поводу мононодозного нетоксического зоба в 2016–2017 гг. Цитологические образцы, полученные при проведении стандартной тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии, подвергнуты молекулярно-генетическому анализу в Институте молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения РАН.

Среди пациентов было 50 (82%) женщин и 11 (18%) мужчин в возрасте от 19 до 64 лет. Проведен анализ только пациентов с мононодозным поражением ЩЖ, исключало ошибки сравнения результатов УЗИ, гистологического исследования и исследование микроРНК.

Результаты

Анализ метода УЗИ-диагностики по системе TIRADS

В данном исследовании, в группу TIRADS 2 (доброкачественные изменения ЩЖ) попало 3 пациента, в 2 случаях был диагностирован коллоидный зоб, у одного пациента — фолликулярная аденома. В группе TIRADS 3 (вероятно доброкачественные изменения ЩЖ) — 33 пациента: в 2 случаях (6,1%) при гистологическом исследовании выявлены доброкачественные образования, в 17 случаях (51,5%) выявлена фолликулярная аденома и в 14 случаях (42,4%) выявлена злокачественная опухоль, что иллюстрирует трудности УЗИ- диагностики злокачественных опухолей в этой группе.

В группе TIRADS IVа (риск малигнизации 5–10%) — у всех 2 пациентов (100%) выявлен папиллярный рак. В группу TIRADS IVb (риск малигнизации 10-80%) попало 14 пациентов: в 2 случаях (14,3%) диагностирована фолликулярная аденома, у 12 (85,7%) выявлены злокачественные опухоли. При TIRADS V у всех 9 пациентов выявлен злокачественный процесс. Все данные суммированы в таблице 1.

Анализ цитологических заключений по системе Bethesda

В группе Bethesda II (18 пациентов) у 12 (61,1%) пациентов по патогистологическому исследованию (ПГИ) выявлен доброкачественный процесс, а вот у 7 (38,9%) — злокачественный.

В группе Bethesda IV (27 пациентов) у 15 (55,6%) выявлена злокачественная опухоль. У 12 (44,4%) выявлена фолликулярная аденома. В данной группе у двух пациентов были признаки злокачественного процесса (наличие дооперационного пареза гортани, подтвержденного осмотром ЛОР-врача), однако по ТАБ диагностирована фолликулярная опухоль.

В группе Bethesda VI у всех 15 пациентов подтверждена злокачественная опухоль. Все данные суммированы в таблице 2.

Анализ молекулярно-генетического метода диагностика

В молекулярный анализ было вовлечено пять типов маркеров: наиболее часто встречающиеся при РЩЖ соматические точечные замены в генах BRAF, HRAS и NRAS; соматическая транслокация RET-PTC1; изменение уровня экспрессии гена HMGA2; изменение уровня экспрессии ряда микроРНК, а также соотношение митохондриальной и ядерной ДНК. Последний маркер, не используемый в существующих диагностических решениях, был добавлен, как признак присутствия клеток Гюртля (В-клеток) в клиническом образце.

Поскольку молекулярный анализ позволяет не только выявлять злокачественный процесс, но и определять тип опухоли, образцы разделялись на следующие группы: доброкачественные образования (ДО), фолликулярные опухоли без маркеров злокачественности (ФОБМЗ), фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности (ФОМЗ), В-клеточные фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности (В-ФОМЗ), папиллярный и медуллярный раки. Если проводить параллели с гистологической классификацией, то группа ФОБМЗ состоит в основном из фолликулярных аденом с некоторым количеством фолликулярных раков, для которых не было обнаружено молекулярных маркеров злокачественности.

Табл. 1.

Классификация УЗ- заключений по TIRADS	TIRADS 2 (n = 3)	TIRADS 3 (n = 33)	TIRADS 4a (n = 2)	TIRADS 4b (n = 14)	TIRADS 5 (n = 9)
Гистологические заключения: 1. Неопухолевое образование (коллоидный зоб, аутоиммунный тиреоидит)	2 (66,7%)	2 (6,1%)	0	0	0
2. Фолликулярная аденома (ФА)	1 (33,3%)	17 (51,5%)	0	2(14,3%)	0
Доброкачественные заключения	3 (100%)	19 (57,6%)	0	2(14,3%)	0
3. Фолликулярный рак (ФР)	0	8 (24,2%)	0	1 (7,1%)	0
4. Фолликулярный вариант папиллярного рака (ФВПР)	0	2 (6,1%)	1 (50%)	3(21,4%)	1(11,1%)
5. Папиллярный рак (ПР)	0	3 (9,1%)	1 (50%)	7 (50%)	8(88,9%)
6. Медуллярный рак (МР)	0	1 (3%)	0	1 (7,1%)	0
Злокачественные заключения	0	14 (42,4%)	2(100%)	12 (85,7)	9 (100%)

Табл. 2.

Классификация цитологического заключения по Bethesda	BethesdaII (n = 18)	Bethesda IV (n = 27)	Bethesda V (n = 1)	Bethesda VI (n = 15)
Гистологические заключения: 1. Неопухолевые образования (коллоидный зоб, аутоиммунный тиреоидит)	3 (16,7%)	0	1 (100%)	0
2.Фолликулярная аденома	8 (44,4%)	12(44,4%)	0	0
Доброкачественные заключения	11(61,1%)	12(44,4%)	1 (100%)	0
3. Фолликулярный рак	4 (22,2%)	5 (18,5%)	0	0
4. Фолликулярный вариант папиллярного рака	2 (11,1%)	3 (11,1%)	0	2 (13,3%)
5. Папиллярный рак	0	6 (22,2%)	0	13 (86,7%)
6. Медуллярный рак	1 (5,6%)	1 (3,7%)	0	0
Злокачественные заключения	7 (38,9%)	15(55,6%)	0	15 (100%)

Табл. 3.

Молекулярно-генетические группы	ДО (n = 3)	ФОБМЗ (n = 15)	ФОМЗ (n = 12)	ПР (n = 27)	В-ФОМЗ (n = 2)	МР (n = 2)
Гистологические заключения: 1. Неопухолевые образования (коллоидный зоб, аутоиммунный тиреоидит)	3 (100%)	0	0	0	1 (50%)	0
2.Фолликулярная аденома	0	12 (80%)	4 (33,3%)	0	1 (50%)	0
Доброкачественные заключения	3 (100%)	12 (80%)	4 (33,3%)	0	2 (100%)	0
3. Фолликулярный рак	0	3 (20%)	6 (50%)	2 (7,4%)	0	0
4. Фолликулярный вариант папиллярного рака	0	0	1 (8,3%)	6 (22,2%)	0	0
5. Папиллярный рак	0	0	1 (8,3%)	19 (70,4%)	0	0
6. Медуллярный рак	0	0	0	0	0	2 (100%)
Злокачественные заключения	0	3 (20%)	8 (66,7%)	27 (100%)	0	2 (100%)

Группа ФОМЗ состоит из фолликулярных раков, части фолликулярных вариантов папиллярного рака и небольшого количества фолликулярных аденом для которых были выявлены молекулярные маркеры злокачественности. Группа В-ФОМЗ соответствует В-клеточным фолликулярным ракам.

Во всех исследованиях из группы Beshesda II (6 человек), у которых по ПГИ диагностирован злокачественный процесс, по микроРНК также был диагностирован злокачественный процесс.

Для 6 случаев расхождения результатов молекулярного анализа и ПГИ было проведено экспертное гистологическое исследование, в результате которого в 3 случаях гистологический диагноз «фолликулярная аденома» был изменен на злокачественный (2 ФВПР и 1 ФР), и 3 случая статус злокачественности не претерпел изменений.

Результаты сравнения молекулярного анализа и ПГИ приведены в таблице 3.

Диагностические характеристики

Полученные в ходе исследования данные позволили определить основные диагностические характеристики разных методов: чувствительность, специфичность, предсказательную ценность положительного результата (ПЦПР), предсказательную ценность отрицательного результата (ПЦОР), диагностическую точность. Эти данные для цитологического и молекулярного анализа (с учетом пересмотра 3 результатов ПГИ) приведены в таблице 4.

Для цитологического анализа невозможно определить диагностические характеристики выявления злокачественных опухолей, так как группа Bethesda IV (фолликулярная опухоль) может включать как доброкачественные, так и злокачественные опухоли, цитологический анализ, как правило, не позволяет их различить.

Молекулярно-генетический анализ метастазов щитовидной железы

Был проведен молекулярный анализ материала с цитологических стекол 16 пациентов с лимфаденопатией шеи с цитологически выявленным РЩЖ. У 6 пациентов, которым была выполнена одномоментная тиреоидэктомия с фасциально-футлярной лимфодиссекцией молекулярный анализ подтвердил метастазирование в паравазальные лимфоузлы, диагностированное при цитологическом исследовании. У 1 пациента была обнаружена транслокация мутация RET-PTC1. У 5 пациентов была выявлена мутация BRAF V600E, что подтверждает более агрессивную форму течения заболевания папиллярного рака с мутацией в гене BRAF. У 5 пациентов подтверждено отсутствие поражения лимфотических узлов.

У 1 пациентки, при УЗИ лимфоузлов шеи по поводу РЩЖ были выявлены подозрительные лимфоузлы. При ТАБ подозрительных лимфоузлов шеи исключено поражение паравазальных лимфоузлов. Интраоперационно тиреоидэктомия была расширена до удаления лимфоуз-

Катанян Г.А., Дурлештер В.М., Измайлова Л.Г. и др. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА УЗЛОВЫХ ОБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА

Табл. 4.

Чувствительность Специфичность ПЦПР ПЦОР Точность Bethesda Цитологический анализ II (n = 18) 0,750 0,737 0,167 0,977 0,738 IV (n = 27) 0,556 0,720 0,741 0,529 0,623 V (n = 1) 0,000 0,958 0,000 0,383 0,377 VI (n = 15) 0,375 1,000 1,000 0,457 0,590 Молекулярный анализ ДО (n = 3) 0,750 1,000 1,000 0,983 0,984 ФОБМЗ (n = 15) 0,600 0,927 0,800 0,826 0,820 ФОМЗ (n = 12) 0,500 0,863 0,417 0,898 0,803 ПР (n = 27) 0,960 0,917 0,889 0,971 0,934 В-ФОМЗ (n = 2) 0,000 0,967 0,000 1,000 0,967 МР (n = 2) 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Злокач. (n = 37) 0,919 0,625 0,791 0,833 0,803 Чувствительность Специфичность ПЦПР ПЦОР Точность Bethesda Цитологический анализ II (n = 18) 0,750 0,737 0,167 0,977 0,738 IV (n = 27) 0,556 0,720 0,741 0,529 0,623 V (n = 1) 0,000 0,958 0,000 0,383 0,377 VI (n = 15) 0,375 1,000 1,000 0,457 0,590 Молекулярный анализ ДО (n = 3) 0,750 1,000 1,000 0,983 0,984 ФОБМЗ (n = 15) 0,600 0,927 0,800 0,826 0,820 ФОМЗ (n = 12) 0,500 0,863 0,417 0,898 0,803 ПР (n = 27) 0,960 0,917 0,889 0,971 0,934 В-ФОМЗ (n = 2) 0,000 0,967 0,000 1,000 0,967 МР (n = 2) 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Злокач. (n = 37) 0,919 0,625 0,791 0,833 0,803 лов шеи III группы. Патогистологическое исследование подтвердило метастатическое поражение удаленных лимфоузлов. Молекулярный анализ выявил в лимфоузлах метастазирование с BRAF мутацией.

У 5 пациентов, у которых исключено поражение лимфоузлов шеи по данным ТАБ при молекулярном анализе выявлены метастазы в лимфоузлы. Все пациенты были повторно пересмотрены, 3 выполнена повторная пункция лимфоузлов, у 2 не выявлена лимфаденопатия. У 1 пациентки подтверждено метастазирование в лимфоузел шеи. Пациентка записана на повторное оперативное лечение. И после оперативного лечения метастазирование в паравазальные лимфоузлы подтвердилось. У остальных поражение лимфоузлов шеи не подтвердилось, так как они все были после радиойодтерапии и вероятнее всего произошла абляция лимфоузлов.

Обсуждение

Результаты трех дооперационных методов диагностики сравнили с результатами послеоперационного гистологического анализа. Точность УЗ-метода для крайних групп (у нас — TIRADS 2 и 5) оказалась достаточно хорошей, для промежуточных групп (3 и 4) — в меньшей степени, например, в группе TIRADS 3 (вероятно доброкачественные изменения ЩЖ) — доброкачественных опухолей и образований оказалось 57,6%, а злокачественных — 42,4%, т.е. почти половина. Таким образом, УЗИ диагностика позволяет надежно выявлять очевидно доброкачественные и злокачественные узлы, в нашем случае это 19,7%, остальные попадают в категорию подозрительных. Цитологический анализ- основной метод дооперационной диагностики, определяющий во многом необходимость операции и ее объем. Этому методу, однако, присущи две проблемы:

• 1.    Даже при адекватном заборе материала в до 30% случаев заключение оказывается неопределенным, поскольку цитологических признаков недостаточно для разделения доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей и, кроме того, часть результатов составляют атипия неясного значения и недиагностический материал, требующие повторной пункции.

• 2.    Результаты анализа сильно зависят от опыта и внимательности специалиста, т.е. в большой степени зависят от личных качеств человека, который проводит анализ. Из группы Bethesda II у 3 пациентов выявлен коллоидный зоб, у 8 пациентов выявлена фолликулярная аденома — доброкачественная опухоль, и, таким образом, в группе Bethesda II оказалось 61,6% доброкачественных опухолей и образований и 38, 9% злокачественных. Последняя цифра является достаточно большой, но надо принять в внимание, что в нашу работу попали только те пациенты, которые были отправлены на операцию, т.е. относительно которых были сомнения в правильности цитологического диагноза. Выявление же злокачественных опухолей характеризовалось 100% специфичностью, но более низкой чувствительностью, поскольку в группу Bethesda VI (злокачественные опухоли) попало только 40%, которые после операции были определены как злокачественные. Остальные в основном попали в группу Bethesda IV (фолликулярные опухоли) и Bethesda II. Молекулярные методы диагностики стали применять лишь несколько лет назад, тем не менее этот метод уже появился в рекомендациях Bethesda 2017 г. Этот подход еще недостаточно отработан, но перспективен, поскольку потенциально может позволить повысить чувствительность и специфичность дооперационной диагностики и, главное, сделать анализ объективным, не зависящим от подготовки специалиста. В нашей работе молекулярно-генетическая диагностика продемонстрировала достаточно высокие диагностические характеристики при выявлении доброкачественных образований, папиллярного раки и медуллярного рака. При выявлении В-клеточного рака (2 случая), однако, с гистологическим анализом было полное несоответствие. Не очень высокая точность (80%)

  
  

была при разделении фолликулярных опухолей на злокачественные и доброкачественные. Тем не менее, когда для шести случаев расхождения молекулярного и гистологического анализа было проведено повторное экспертное исследование, в трех случаях гистологический диагноз «фолликулярная аденома» был изменен на злокачественный. Наши данные так же продемонстрировали, что молекулярный анализ может быть использован для выявления метастазов в лимфоузлах (по крайней мере, папиллярного рака), однако, данных пока недостаточно для определения чувствительности и специфичности такой диагностики.

Заключение

Молекулярно-генетическое исследование позволяет улучшить дифференциальную диагностику рака, превышая по точности, в ряде случаев, гистологическое исследование. Целесообразно использовать молекулярно-генетическое исследование при получении неопределенных результатов цитологического исследования: 3 и 4 класс по Bethesda, а также при противоречивых результатах цитологического, ультразвукового и гистологического исследований. Требуется улучшить метод с помощью использования новых молекулярных маркеров, особенно в плане разделения фолликулярных опухолей на доброкачественные и злокачественные

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).

Doi: 10.1002/emmm.201100209.