Дифференцированная оценка антибиотиков на способность ограничивать скольжение Mycobacterium smegmatis

Изучение механизмов, лежащих в основе координированных действий микробных клеток, направленных на эффективное распространение по поверхности и формирование колониальных и биопленочных сообществ, приобретает все большую актуальность в связи с тем, что такие «поведенческие» реакции сопровождаются образованием толерантных к антибиотикам форм бактерий [Verstraeten et al., 2008; Thayil et al., 2011]. В случае с патогенными микроорганизмами, это сопровождается развитием не поддающихся лечению антибиотиками рецидивирующих хронических инфекций, в особенности вызванных Mycobacterium tuberculosis .

В отличие от жгутиковых микроорганизмов, микобактерии не способны к направленному дви- жению и роению и до недавнего времени считались абсолютно неподвижными. Однако в конце 90-х гг. прошлого века было показано, что микобактерии способны к скольжению (sliding) – особому типу пассивного движения по поверхности [Martinez, Torello, Kolter, 1999], который ранее был описан для других безжгутиковых форм [Henrichsen, 1972]. Распространение скользящей колонии реализуется за счет деления бактерий и возникающей при этом экспансивной силы, которая проталкивает клетки вперед [Daffé, Draper, 1997]. Для облегчения скольжения микроорганизмы могут продуцировать поверхностно активные вещества, уменьшающие трение о поверхность, например рамнолипиды у некоторых грамотрица-

тельных бактерий [Murray, Kazmierczak, 2008]. Хотя скольжение микобактерий не зависит от наличия специфических соединений в матриксе, тем не менее, установлено, что мутанты, у которых в клеточной стенке отсутствовали гликопептидо-липиды, теряли подвижность [Recht et al., 2000; Ghosh, Indi, Nagaraja, 2013]. О регуляции скольжения микобактерий известно немного, однако показано, что переход к скольжению у микобактерий контролируется при участии сигнальных нуклеотидов (p)ppGpp и c-di-GMP, которые не только оказывают влияние на поверхностные свойства клеток, в том числе содержание в их клеточных стенках гликопептидолипидов, но и ответственны за формирование толерантности к антибиотикам [Thayil et al., 2011; Gupta et al., 2016].

Особенности строения многокомпонентной клеточной стенки микобактерий придают им свойства повышенной устойчивости к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды, включая антибиотики и компоненты иммунной системы хозяина. От этого зависит также способность микобактериальных клеток к скольжению и биопленкообразованию, что позволяет им колонизировать субстраты и персистировать в окружающей среде [Etienne et al . , 2005]. В свою очередь, способность к скольжению часто используется для характеристики поверхностных свойств и физиологического состояния микобактерий.

В последнее время активно ведутся поиски эффективных ингибиторов межклеточных взаимодействий, нарушающих функционирование бактериальной системы quorum sensing (QS), агрегацию, адгезию и движение клеток по поверхности субстратов, то есть процессов, играющих основную роль в биопленко-образовании и персистенции. Ранее показано, что некоторые группы соединений могут оказывать значительное влияние на способность микобактерий к скольжению (ПАВ, синтетические гликолипиды, регуляторы метаболизма, биогенные полиамины, антибиотики) [Gopalaswamy et al., 2008; Naresh et al . , 2010; Syal et al . , 2016; Нестерова, Цыганов, Ткаченко, 2017]. Причинами уменьшения диаметра скользящей колонии при их действии может быть не только ингибирование процесса скольжения, но и снижение жизнеспособности бактериальных клеток в результате токсического действия. Это ставит задачу дифференцировать два вида активности при изучении механизма действия исследуемых соединений, что составляет цель данной работы.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служил штамм Mycobacterium smegmatis mc² 155 из коллекции лаборатории адаптации микроорганизмов

Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Скользящие колонии выращивали в полистироловых чашках Петри (Thermo scientific, 35 мм). В жидкую среду Middlebrook 7H9 (Difco, Франция) добавляли агарозу (Хеликон, Россия) в концентрации 0.3%. Антибиотики вносили в остывшую до температуры 47^оС питательную среду, которую разливали по чашкам и подсушивали в течение 40 мин. Культуру M. smegmatis выращивали на питательной среде Middlebrook 7H9 до оптической плотности (ОП) 1.3 (600 нм), разводили до ОП 0.4 (600 нм), наносили на агар в центр чашки Петри каплей (2 мкл) и оставляли в термостате (37^оС) на 48 ч.

Подсчет клеток в колонии проводили под микроскопом в камере Горяева. Колонию вырезали вместе с полужидким агаром и помещали в микропробирку, куда вносили физиологический раствор с добавлением tween 80 (0.05%) до конечного объема 1 мл и стеклянные бусы (2 мм, Hofmann Glastechnik, Германия). Микропробирку встряхивали на вортексе (1400 об/мин.; 1ч.). После этого производили подсчет клеток в камере Горяева в 60 малых квадратах по диагонали. Количество клеток на мм2 колонии рассчитывали по формуле

N = (mx4000xs/q)x1000, где N – число клеток в 1 мл раствора; m – сумма посчитанных клеток; s – степень разведения; q – число малых квадратов сетки камеры Горяева, в которых считали клетки.

Измерение площади колонии проводили после фотографирования чашки со скользящей колонией с помощью камеры Olympus C-3040 ZOOM (Япония) с использованием пробной версии программы Adobe Photoshop CC 2015.5, определяя количество пикселей и их площадь.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли методом двукратных серийных разведений в 96-луночных полистироловых планшетах на среде Middlebrook 7H9 с добавлением tween 80 (0.05%). Приготовление инокулята: культуру M. smegmatis выращивали на среде Middlebrook 7H9 до ОП 1.0 (600нм), затем доводили до ОП 0.1 и разводили ещё в 10 раз. В лунки планшета, содержащие 100 мкл питательной среды с антибиотиком, вносили 100 мкл инокулята. Культивировали 48 ч. в термошейкере Biosan PST-60HL (Латвия) при 37 ° С и 300 об/мин. МПК считали минимальную концентрацию антибиотика, подавляющую видимый рост микроорганизмов.

Для того чтобы определить, сопровождается ли уменьшение размера скользящей колонии уменьшением количества клеток, подсчитали количество бактерий на 1 мм2 скользящей колонии. Эффект ограничения скольжения без бактерицидного действия фиксировали в том случае, если хотя бы при одной из концентраций, достоверно уменьшающих размер скользящей колонии, наблюдалось статистически значимое увеличение количества клеток на мм2 колонии по сравнению с контролем.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета стандартных программ Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., 2006). На графиках отражены средние значения (4–8 экспериментов), вертикальными отрезками обозначены величины стандартной ошибки среднего. Оценка статистической значимости различий произведена с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р≤0.05.

Результаты

В качестве соединений, способных оказать влияние, как на скольжение, так и на численность клеток в скользящих колониях М. smegmatis , в работе использованы антибиотики, обладающие антимикобактериальной активностью: рифампицин, стрептомицин и тетрациклин.

Действие рифампицина связано с подавлением активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы [Се-лизарова, 2003], в то время как стрептомицин и тетрациклин блокируют синтез белка, связываясь с 30S субъединицей рибосомы и нарушая образование комплекса рибосомы с т-РНК соответственно [Epe, Woolley, Hornig, 1987; Егоров, 2004].

Антибиотики добавляли в полужидкую питательную среду, которая использовалась для воспроизведения скольжения микобактерий на чашках Петри (см. раздел «Материалы и методы»). Концентрации антибиотика были подобраны таким образом, чтобы отследить постепенное уменьшение размеров скользящей колонии. Для того, чтобы сравнить между собой эффекты антибиотиков, обладающих разным механизмом действия, их концентрацию выражали в условных единицах, кратных значению минимальной подавляющей концентрации. Для рифампицина она была равна 9.7, стрептомицина – 0.04, а тетрациклина – 0.57.

Результаты исследования показали, что присутствие даже минимальных концентраций рифампицина и тетрациклина в среде (0.06 МПК) приводило к снижению площади колонии по сравнению с контрольным значением приблизительно в 2 и 1.5 раза соответственно (рис. 1, 2). Однако содержание клеток в колонии, выросшей в присутствии этих антибиотиков, существенно различалось. При этом численность клеток на единицу площади колонии в присутствии рифампицина возрастала обратно пропорционально изменению ее площади. В то же время снижение площади колонии в ответ на добавку 0.06 МПК тетрациклина не сопровождалось возрастанием количества клеток на единицу площади, которое оставалось на уровне контрольного. Это свидетельствует о том, что рифампицин в данной концентрации практически не влиял на размножение клеток, но существенно ингибировал их скольжение. В отличие от этого эффект тетрациклина, по-видимому, был вызван ингибировани- ем роста и размножения клеток.

Рис. 1 . Влияние рифампицина на скольжение Mycobacterium smegmatis mc² 155:

МПК – минимальная подавляющая концентрация; К – контроль; А – фото скользящих колоний; В – изменение площади колоний и числа клеток на 1 мм² колонии; * – статистически значимое отличие площади колонии от контрольной группы (с использованием t-критерия Стьюдента, р≤0.05); х – статистически значимое отличие числа клеток на 1 мм² от контрольной группы в большую сторону (с использованием t-критерия Стьюдента, р≤0.05)

Рис. 2 . Влияние тетрациклина на скольжение Mycobacterium smegmatis mc² 155:

МПК – минимальная подавляющая концентрация; К – контроль; А – фото скользящих колоний; В – изменение площади колоний и числа клеток на 1 мм² колонии; * -статистически значимое отличие площади колонии от контрольной группы (с использованием t-критерия Стьюдента, р≤0.05

Дальнейшее повышение концентрации рифампицина и тетрациклина подтвердило тенденцию в изменении исследуемых параметров, выявленную при воздействии относительно малых концентраций антибиотиков (рис. 1, 2). При этом повышение концентрации рифампицина вызывало более выраженное ингибирование скольжения по сравнению с изменением количества клеток на единицу площади (рис. 1 – заштрихованная область).

Прямо противоположная тенденция характерна для тетрациклина (рис. 2) и стрептомицина (рис. 3), при действии которых оба параметра менялись сходным образом, что свидетельствует о преобладании бактерицидного или бактериостатического эффекта, вносящего наибольший вклад в снижение диаметра колонии.

Рис. 3 . Влияние стрептомицина на скольжение Mycobacterium smegmatis mc² 155:

МПК – минимальная подавляющая концентрация; К – контроль; А – фото скользящих колоний; В – изменение площади колоний и числа клеток на 1 мм² колонии; * – статистически значимое отличие площади от контрольной группы (с использованием t-критерия Стьюдента, р≤0.05)

Обсуждение

Особенности клеток Mycobacterium smegmatis, включая их способность к агрегации во время культивирования, затрудняют определение количества живых организмов в популяции. Использование с этой целью высева образцов культуры на твердую питательную среду для подсчета КОЕ может давать ошибочные результаты. Как показали результаты наших микроскопических исследований, в процессе ресуспендирования скользящей колонии, даже после интенсивного встряхивания с ПАВ, не все клетки микобактерий расходились, частично оставаясь в виде скоплений. Однако используемый нами подсчет в камере Горяева давал возможность точно учитывать не только отдельно расположенные, но и клетки в составе скоплений. Данный метод обеспечивал высокую воспроизводимость результатов. Использование программы Adobe Photoshop, в свою очередь, сделало возможным быстрое и точное определение площади колонии с учетом неровностей её края.

Ранее нами показано, что площадь скользящей колонии может уменьшаться не только в результате торможения деления или бактерицидного действия антибактериальных соединений, но и за счет ингибирующего эффекта не токсичных для бактерий веществ на процесс скольжения [Нестерова, Цыганов, Ткаченко, 2017]. В этом случае действующие вещества могут, проникая в клетку, оказывать регуляторное действие на процессы, контролирующие скольжение, а также взаимодействовать с бактериальной поверхностью, изменяя ее свойства, что сказывается как на характере взаимодействия с субстратом, так и на межклеточных контактах.

Сходное действие могут, по-видимому, оказывать также соединения, обладающие противо-микробной активностью, что может быть выявлено при их использовании в субингибиторных концентрациях. Дифференцировать противомик-робный эффект от влияния на уровне межклеточных коммуникаций или взаимодействия между клетками и средой важно для установления механизма действия вновь открываемых антибактериальных соединений. Это становится особенно актуально в связи с предпринимаемыми в последнее время усилиями по поиску антибиотиков, действие которых направлено на подавление процессов, находящихся под регуляторным контролем QS-системы, включая формирование биопленок, вирулентность, координированное перемещение по твердой поверхности, персистенцию и другие [Garrison et al., 2015; Gutiérrez-Barranquero et al., 2015; Нестерова, Ткаченко, Писцова, 2016].

Таким образом, предложенный нами дифференцированный подход к оценке различных соединений по способности воздействовать на бактериальное скольжение с учетом их возможной антибактериальной активности может быть использован для установления механизма действия новых антибиотиков, а также для изучения их эффекта на свойства клеточной поверхности микобактерий и других микроорганизмов, способных к скольжению.

Работа выполнена в рамках госзадания, номер госрегистрации темы 01201353249 и при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта р_а 16-44590279.