Динамический скрининг предраковых состояний пищевода с помощью молекулярно-генетического анализа

АП обычно возникает в столбчатом метапластическом эпителии пищевода, который известен как пищевод Барретта (ПБ). Установленные факторы риска для АП и ПБ включают симптоматическую гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, европейское происхождение, мужской пол, ожирение и курение табака [3].

Несмотря на то, что АП диагностируется только в 5–8 % случаев на фоне ПБ, динамическое наблюдение за пациентами с этим заболеванием рекомендуется медицинскими сообществами и активно практикуется в течение последних двух десятилетий. Связано это с тем, что хотя только 7 % пациентов в популяции, наблюдающихся по поводу ПБ, умирают от АП, отмечено, что 66,5 % АП возникают в течение 1 года после первоначального эндоскопического диагноза ПБ [3].

Эзофагогастродуоденоскопия с четырьмя квадрантными биопсиями для выявления дисплазии и ранней инвазивной аденокарциномы является единственным методом скрининга, который в настоящее время рекомендуется для пациентов с ПБ [4, 5]. При этом, несмотря на значительное увеличение использования эндоскопии, клинически в популяции выявляется только треть пациентов с ПБ, а остальные остаются недиагностированными. Основными ограничениями при использовании диагноза дисплазии слизистой при ПБ в качестве маркера потенциального развития АП являются субъективность при оценке степени дисплазии и значительные расхождения среди патологов при диагностике предраковых изменений слизистой при морфологическом исследовании. При этом различие национальных клинических рекомендаций по отношению к дисплазии легкой степени ПБ и по отношению к желудочной метаплазии ПБ обусловливает субоптимальное согласие между экспертами. Даже среди опытных патологов в диагностике дисплазии у пациентов с ПБ имеются разногласия [6]. Низкая выявляемость и высокая стоимость скрининга требуют поиска более эффективных методов и биомаркеров для выявления пациентов с высоким риском прогрессирования ПБ в АП. Такими маркерами могут выступать микроРНК (миРНК), небольшие некодирующие РНК, задействованные в посттранскрипционной регуляции генов. При развитии онкологического процесса они могут выступать и как онкогены, и как опухолевые супрессоры в различных тканях [7]. МиРНК, помимо всего прочего, связаны с воспалительными процессами [8], которые могут играть важную роль в развитии ПБ. Также предполагается, что миРНК можно использовать для прогноза развития заболевания [9].

Цель исследования – изучение перспективности применения классификатора, основанного на профилировании миРНК, для исследования гистологических образцов ПБ для определения риска злокачественности и тактики лечения.

Материал и методы

Выделение РНК. К 2–3 5-мкм срезам парафинового блока добавляли 1 мл белого парафинового масла (класс вязкости ISO VG 15), инкубировали в термошейкере при 65 ºС 2 мин. Центрифугировали при 13000 g в течение 2 мин. К осадку добавляли 700 мкл лизирующего гуанидинового буфера (4 М гуанидин изотиоцианат; 25 мМ цитрат натрия; 0,3 % саркозил; 100 мМ Трис-HCl pH 6,5; 0,1 % 2-меркаптоэтанол) и оставляли в термошейкере при 90 ºС на 60 мин. Центрифугировали при 13000 g в течение 2 мин, после чего супернатант переносили в новые пробирки. Далее в пробирки добавляли 600 мкл изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугировали 10 мин при 13000 g, затем супернатант сливали, осадок промывали сначала 500 мкл 70 % этанола, а затем 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деионизированной воды.

Выявление микроРНК. Детекцию 7 миРНК и малой ядерной РНК (мяРНК) U6 с помощью ОТ-ПЦР-РВ проводили для всех типов образцов. Для выявления зрелых миРНК использовали метод stem-loop ОТ-ПЦР. Для каждой миРНК отдельно проводили реакцию обратной транскрипции с последующей ПЦР-РВ [10]. Для каждого образца анализ проводили в одном повторе. Нормировку содержания миРНК проводили на содержание мяРНК U6 в образце с помощью метода 2^-ΔCqс учетом эффективности реакций. Выявление мяРНК U6 проводилось по той же схеме stem-loop ОТ-ПЦР, которая использовалась для миРНК.

Классификатор. Образцы изначально были классифицированы так, как описано ранее [11]. Дерево принятия решения выглядело следующим образом:

миР-150 > -14,12

миР-31 > -39,41

миР-145 > -3,19 Диагноз = РЖ миР-145 ≤ -3,19 Диагноз = Дисплазия миР-31 ≤ -39,41 Диагноз = РЖ миР-150 ≤ -14,12

миР-34a > -49,18

миР-21 > -3,08 Диагноз = РЖ миР-21 ≤ -3,08 Диагноз = Норма миР-34a ≤ -49,18

миР-375 > -22,82 Диагноз = Норма миР-375 ≤ -22,82 Диагноз = Дисплазия

Обработку данных проводили в программе Excel (Microsoft, США). Стратификацию образцов на разные группы проводили методом построения дерева принятия решений C-RT (Classification and Regression Tree) [12].

Результаты

миР-150 > -34,29

миР-31 > -56,17

миР-145 > -10,59

миР-21 > -1,21 Диагноз = Дисплазия миР-21 ≤ -1,21 Диагноз = РЖ миР-145 ≤ -10,59

миР-375 > -247,85 Диагноз =

= Дисплазия миР-375 ≤ -247,85 Диагноз = Норма миР-31 ≤ -56,17 Диагноз = РЖ миР-150 ≤ -34,29

миР-145 > -62,91

миР-21 > -1,67 Диагноз = РЖ миР-21 ≤ -1,67

миР-34a > -39,98 Диагноз = РЖ миР-34a ≤ -39,98 Диагноз = Норма миР-145 ≤ -62,91

миР-20 > -10,47 Диагноз = РЖ миР-20 ≤ -10,47 Диагноз = Дисплазия

Таким образом, в дерево решений вошли все миРНК, включая миРНК-20а. Данные о диагностических характеристиках определения РЖ и дисплазии с помощью этого дерева решений в сравнении с предыдущей версией представлены в табл. 1.

Таблица 1/table 1

Диагностические характеристики выявления РЖ и дисплазии, полученные в данном и в предыдущих исследованиях diagnostic characteristics of the detection of gastric cancer and dysplasia obtained in this and in the previous study

Диагностические характеристики/ Diagnostic characteristics	Дерево принятия решения – данная работа/ Decision Tree – this study		Дерево принятия решения из работы [11]/ Decision Tree from the study [11]
	РЖ (95 % ДИ)/ Gastric cancer (95 % CI)	Дисплазия (95 % ДИ)/ Dysplasia (95 % CI), %	РЖ (95 % ДИ)/ Gastric cancer (95 % CI)	Дисплазия (95% ДИ)/ Dysplasia (95 % CI)
Специфичность/ Specificity	94 % (90–97 %)	92 % (83–97 %)	93 % (86–97 %)	97 % (90–99 %)
Чувствительность/ Sensitivity	94 % (80–99 %)	94 % (89–97 %)	91 % (76–98 %)	87 % (75–94 %)
Общая точность/ Accuracy	94 % (90–97 %)	94 % (90–97 %)	93 % (86–96 %)	93 % (86–96 %)
ПЦПР/ PPV	76 % (63–85 %)	96 % (92–98 %)	84 % (70–92 %)	96 % (85–99 %)
ПЦОР/ NPV	99 % (95–99 %)	89 % (80–94 %)	96 % (90–99 %)	90 % (82–95 %)

Примечание: ПЦПР – предсказательная ценность положительного результата; ПЦОР – предсказательная ценность отрицательного результата; ДИ – доверительный интервал.

Notes: PPV – positive predictive value; NPV – negative predictive value; CI – confidence interval.

Таблица 2/table 2

Результаты стратификации образцов ПБ с помощью дерева принятия решения, полученного в данной работе

the results of stratification of Barrett's esophagus samples using the decision tree obtained in this study

Заключение на основании экспрессии миРНК/ Conclusion based on miRNA expression

Количество/Quantity

Нормальная слизистая/ Normal mucosa

Дисплазия/Dysplasia

3 (10 %)

19 (63,3 %)

Рак/Cancer

8 (26,7 %)

выявления предраковых изменений эпителия и аденокарциномы пищевода. Было исследовано 30 гистологических образцов ПБ, однако только 28 относились к разным пациентам, у одного пациента было 3 операционных образца с известным гистологическим заключением – аденокарцинома пищевода. Следует отметить, что те три образца, для которых был известен послеоперационный диагноз, попали в группу «Рак» (табл. 2).

Обсуждение

Аденокарцинома пищевода развивается из ПБ, при котором нормальный многослойный плоский эпителий заменяется специализированной кишечной метаплазией в ответ на хронический рефлюкс в пищевод желудочной кислоты. У части людей ПБ может прогрессировать до дисплазии низкой и высокой степени (low-grade и high-grade) и в конечном итоге приводить к внутриэпителиальной, а затем инвазивной карциноме. Молекулярные исследования ПБ показали, что при кишечной метаплазии возникают изменения, которые также присутствуют в слизистой пищевода при дисплазии и в АП. Как ПБ, так и АП характеризуются потерей гетерозиготности, анеуплоидией, специфическими генетическими мутациями и клональным разнообразием.

Национальные рекомендации по текущему ведению ПБ в Великобритании и США советуют повторять эндоскопическое исследование через регулярные интервалы наблюдения [3, 13]. Динамический скрининг направлен на увеличение доли пациентов, у которых опухолевые образования выявляются на ранних стадиях (ВЭН или неинвазивной карциномы), чтобы можно было проводить эндоскопическое лечение. За прошедшие годы появились противоречивые данные о пользе скрининга. В исследовании, отражающем повседневную клиническую практику, эндоскопическое наблюдение не привело к значительному снижению риска смерти от АП [4].

С другой стороны, метаанализ 51 исследования, включающего более 11 000 пациентов, показал, что эндоскопическое наблюдение у больных с недиспластическим ПБ увеличивает вероятность раннего выявления опухоли и, следовательно, снижает риск смертности более чем на 61 % [5]. Эти данные были подтверждены результатами проспективного многоцентрового когортного исследования из Нидерландов [14]. Таким образом, рекомендуется, чтобы у всех пациентов с ПБ целевые биопсии были взяты из участков видимых поражений, подозрительных на диспластические изменения слизистой оболочки, а также из четырех «случайных» фрагментов ткани с интервалами 2 см по всей протяженности сегмента ПБ – так называемый протокол Сиэтла [15].

Возможно, одним из наиболее важных вопросов при рассмотрении мониторинга пациентов является качество гистопатологического диагноза. В клинической практике выбор тактики лечения основан на субъективных оценках патоморфологов, которые могут иметь значительные расхождения в гистологическом диагнозе, особенно в отношении оценки степени дисплазии. Пока не будет разработан и утвержден более надежный инструмент диагностики, дополняющий морфологическое исследование, оценка должна проводиться двумя независимыми специалистами по патологии желудочно-кишечного тракта.

Прогрессирование ПБ в АП представляет собой патогенетический механизм, характеризующий процесс перехода в рак предшествующего патологического процесса. Геномные исследования ПБ показали, что это не просто метапластическая ткань, но что во многих случаях ПБ имеются соматические генетические изменения и почти при всех поражениях ПБ есть существенные эпигенетические изменения по сравнению с нормальной слизистой пищевода или кардии [16]. Анализ молекулярных изменений, отмеченных в процессе развития ПБ, был значительно улучшен благодаря значительному прогрессу в геномных технологиях, включая инструменты для изучения вариантов соматических мутаций, важные структурные изменения и эпигенетические изменения (метилирование ДНК, экспрессия миРНК) в раковых и предраковых клетках [17].

Одна из основных целей нашей работы состоит в оценке диагностической значимости миРНК в качестве потенциальных биомаркеров при скрининге изменений слизистой пищевода при кишечной метаплазии, для раннего выявления злокачественного поражения. Различные профили экспрессии миРНК для выявления РЖ определяют достаточно давно, однако результаты исследований нередко противоречат друг другу, что мешает решить проблему ранней диагностики опухолей и предопу-холевых процессов с помощью профилирования миРНК [9].

Клинический пример

Мужчина, 43 лет. Диагноз при поступлении: Кардиоэзофагеальный рак TxNxM0 (I тип по Siewert). Из анамнеза известно, что в 2015 г. выявлена гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, ПБ. При гистологическом исследовании биоптатов из нижней трети слизистой пищевода обнаружены: кишечная метаплазия, циркулярное поражение, дисплазия легкой степени тяжести. Выполнена радиочастотная абляция, через 1 мес повторена биопсия слизистой пищевода и проведена лапароскопическая фундопликация. В дальнейшем продолжено консервативное лечение препаратами из группы ингибиторов протонной помпы.