Динамика численности микроорганизмов в нефтезагрязненной дерново-карбонатной почве в процессе ремедиации

ции: 1) обеспечение самовосстановления путем активизации аборигенной микрофлоры (рыхление, внесение удобрений); 2) обработка in situ путем внесения в почву микроорганизмов – деструкторов и биологически активных соединений; 3) микробная деградация в биореакторах, обеспечивающих за счет перемешивания контакт микроорганизмов с водонерастворимыми загрязнителями [Weaver et al, 1998; White, Shauman, Gadd, 1998; Murygina, Arinbasarov, Kalyuzhnyi, 2000; Салангинас, 2003; Оборин, Хмурчик, Илларионов, 2008]. Несмотря на большое количество работ по микробиологии нефтезагрязненных почв, данных о чувствительности и устойчивости разных групп почвенных организмов к воздействию нефти и нефтепродуктов до сих пор недостаточно.

Установлено, что в окислении нефтяных углеводородов принимают участие бактерии (22 рода), мицелиальные грибы (24), дрожжи (19), зеленые микроводоросли ( Chlamydomonas и Chlorella ), а также жгутиковые простейшие ( Euglena ) [Замотаев и др., 2015]. Комплекс почвенных микроорганизмов как биосистема динамичен; состав микробо-ценозов, его структура изменяются непрерывно в ходе длительного и сложного процесса биологического разложения углеводородов. Другими словами, биодеградация углеводородов, протекающая в пространстве и во времени, определяет и направленность микробных сукцессий.

На территории Пермского края эксплуатируется более 100 месторождений нефти, перспективы открытия новых месторождений достаточно высоки. Аварийные проливы и утечки нефти распространены на территории нефтепромыслов, участках эксплуатации нефтепроводов. Согласно картам устойчивости почв к нефтезагрязнению, регион входит в ареал с высокой устойчивостью почв (с высокой скоростью разложения, с умеренным и сильным рассеянием углеводородов), который наряду с другими включает дерновоподзолистые почвы, подзолистые почвы, серые почвы, черноземы выщелоченные [Геннадиев, Пиков-ский, 2015].

По данным А.А. Оборина, В.Т. Хмурчик, С.А. Илларионова [2008], дерново-подзолистые почвы подзоны южной тайги характеризуются достаточно богатым и разнообразным микробоценозом, в котором доминируют бактерии – гетеротрофы. После загрязнения, в первые дни резко снижена микробиологическая и биохимическая активность почвы, окисление нефти идет за счет физико-химических факторов. Через несколько дней активно развиваются углеводородокисляющие бактерии, в период до 2 лет их содержание превышает фоновый уровень. Грибы и актиномицеты также осуществляют деструкцию органических соединений, наиболее часто способность усваивать углеводороды встречается у представителей родов Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor и др. Второй этап деградации нефти в Предуралье длится 2–3 года и характеризуется увеличением общей численности грибов, актиномицетов, споровых и неспорообразующих бактерий. В конце этапа снижается общая численность микроорганизмов, в почве остаются в основном сложные полициклические и гетероциклические соединения, обладающие канцерогенными свойствами.

Несмотря на проведенные исследования в районах нефтедобычи Предуралья [Кристофи и др., 1996; Красавин, Катаева, Оборин, 2006; Оборин, Хмурчик, Илларионов, 2008; Назаров и др. 2010], вне внимания исследователей осталась проблема восстановления нефтезагрязненных дерново-карбонатных почв.

Почвы на элювии известняков и мергелей широко представлены во всех равнинных провинциях Пермского края, за исключением самых северных. Они занимают верхние части и перегибы склонов, вершины и склоны холмовидных возвышений [Коротаев, 1962; Агрохимическая …, 1964; Протасова, 2009]. Дерно-во-карбонатные глинистые почвы в Пермском крае занимают 288 тыс. га, 1.8% территории; распахано 203 тыс. га этих почв [Почвенная …, 1978]. На основе оцифрованной почвенной карты М 1:300000 [Филькин и др., 2014] выделены площади, занимаемые дерново-карбонатными почвами (рисунок).

Км

Дерново-карбонатные почвы в Пермском крае:

1 – водные объекты, 2 – ареалы почв

В классификации почв России дерново-карбо-натные почвы с общей мощностью рыхлой толщи более 30 см вошли в отдел органо-аккумулятивных почв, тип серогумусовых (дерновых). У них ясно выраженный гумусовый горизонт постепенно сменяется почвообразующей породой. Срединный горизонт не выражен: средняя часть профиля не имеет педогенной структурной организации, ясно выраженных свидетельств суспензионного переноса, иллювиирования органоминеральных соединений. Возможно проявление их на уровне признаков [Классификация …, 2004].

Цель наших исследований – проследить динамику численности углеводородокисляющих микроорганизмов в процессе восстановления нефтезагрязненной агродерново-карбонатной (серогумусовой) почвы на фоне применения биопрепарата.

Материал и методы исследований

Опыты были заложены на свежезалежном участке агродерново-карбонатной глинистой почвы. Пахотный горизонт почвы имел серо-коричневую окраску, комковато-зернистую структуру и рыхлое сложение, глинистый гранулометрический состав, содержал кусочки извести. Переходный к породе горизонт – красно-коричневой окраски, крупнозернистый, глинистый. С глубины около 40–50 см отмечено присутствие плотных карбонатных включений.

В соответствии с критериями Н.Б. Мякиной и Е.В. Аринушкиной [1979] агродерново-карбо-натная почва опытного участка (слой 0–20 см, 5-кратная повторность) характеризовалась слабокислой реакцией (рН (КCl) = 5.2 + 0.15), средним содержанием гумуса (2.1 + 0.15%), азота (N-NО 3 = 3.4 + 0.6 мг/кг почвы), подвижного фосфора (Р 2 О 5 = 125 + 17 мг/кг почвы) и калия (К 2 О = 91.6 + 1.0 мг/кг почвы).

Во второй половине мая 2007 г. почву загрязнили нефтью в количестве 5, 10 и 20 л/м2. Через неделю после загрязнения был внесен препарат Альбит в виде суспензии из расчета 50, 100 и 200 л/га (соответственно увеличению дозы нефти). Альбит – комплексный препарат, обладающий свойствами регулятора роста, фунгицида, удобрения (патент РФ № 2147181). Рыхление почвенного слоя на глубину 0–20 см проводили один раз в неделю в течение двух месяцев, одновременно поливали водой 20 л/м2. Осенью на участке посеяны многолетние травы.

Численность некоторых микроорганизмов в почве определили через 35 дней после ремедиации в 2007 г., затем в середине лета 2010 и 2015 гг.

Для определения численности и таксономического состава комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов применяли метод посева на ага-ризированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду и среду Чапека с гексадеканом. Посевы инкуби- ровали при комнатной температуре 3–7 сут., затем проводили подсчет и микроскопирование выросших колоний. Идентификацию бактерий и грибов до рода проводили на основании изучения культуральных и микроморфологических признаков [Хо-улт, Криг, Снит, 1997].

Количество остаточной нефти и бенз(а)пирена определили через 70 дней после внесения биопрепарата в 2007 г., затем летом 2010, 2015 и 2017 гг. Содержание углеводородов нефти определили методом жидкостной хроматографии (РД-39-0147098-015-90); содержание бенз(а)пирена – методом вольтамперометрии (ГОСТ Р-506984-94).

Результаты и их обсуждение

В незагрязненной агродерново-карбонатной почве опытного участка установлена численность колониеобразующих единиц (КОЕ) некоторых уг-леводородокисляющих микроорганизмов. Ассоциация бактерий включала следующие многочисленные роды: Rhodococcus (10⁸ КОЕ/г почвы) = Agrobactrium (10⁸) >  Bacillus (10⁷) >  Pseudomonas (10⁶) = Clavibacter (10⁶) >  Xanthomonas (10⁵); сообщество мицелиальных микромицетов представлено родами: Penicillium (10⁸) = Phytophtora (10⁸) >  Fusarium (10⁶) = Rhizoctonia (10⁶).

Нашими исследованиями в течение ряда лет прослежена динамика численности трех родов бактерий и 3 родов микромицетов в нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почве на фоне применения биопрепарата.

Если в незагрязненной агропочве было примерно равное соотношение бактерий и микромице-тов, то через 35 дней после нефтезагрязнения в целом прослежено подавление всей микробиоты, которое усиливалось с увеличением дозы нефти (табл. 1). При дозе нефти 10 и 20 л/м2 КОЕ бактерий вообще не выявлено, одновременно доля мик-ромицетов резко возрастала. Внесение биопрепарата Альбит поддержало бактериальную микробиоту по всем дозам внесенной нефти, численность КОЕ бактерий и микромицетов была приблизительно равной.

Таблица 1

Численность микроорганизмов в слое 0–20 см агродерново-карбонатной почвы через 35 дней после начала ремедиации, КОЕ/г почвы, 2007 г.

Вариант	Pseudomonas	Rhodococcus	Xantomonas	Phytoptora	Rhizoctonia	Fusarium
Контроль	107	108	105	108	106	106
Нефть 5 л/м2	102	0	102	103	102	104
Нефть 5 л/м2 + Альбит	104	103	102	102	102	102
Нефть 10 л/м2	0	0	0	104	103	103
Нефть 10 л/м2 + Альбит	103	102	103	102	102	102
Нефть 20 л/м2	0	0	0	103	103	103
Нефть 20 л/м2 + Альбит	102	102	103	102	102	102

Исследования, проведенные через три года (2010), показали, что в контрольном варианте бактерий больше, чем микромицетов. В нефтезагрязненой почве доминировали микромицеты. При дозе нефти 20 л/м2 из бактерий обнаружены только КОЕ

Xantomonas. Из-за высокой численности микромице-тов общее количество КОЕ микроорганизмов на варианте с меньшим загрязнением не ниже, чем на контроле. На больших дозах нефти общая численность микроорганизмов в почве несколько уступала неза- грязненному варианту (табл. 2).

Таблица 2

Численность микроорганизмов в слое 0–20 см агродерново-карбонатной почвы, КОЕ/г почвы, 2010 г.

Вариант	Pseudomonas	Rhodococcus	Xantomona s	Phytoptor a	Rhizoctoni a	Fusarium
Контроль	108	106	108	104	102	102
Нефть 5 л/м2	102	102	102	108	108	108
Нефть 5 л/м2 + Альбит	106	104	104	104	102	104
Нефть 10 л/м2	102	102	102	108	106	108
Нефть 10 л/м2 + Альбит	104	104	104	104	102	102
Нефть 20 л/м2	0	0	102	108	108	108
Нефть 20 л/м2 + Альбит	104	104	104	104	102	102

Биопрепарат продолжал оказывать положительное последействие на бактерии, но численность КОЕ всех трех родов все же уступала контролю. По дозам нефти 10 и 20 л/м2 установлена почти одинаковая картина в количестве и соотношении исследуемых микроорганизмов.

Через 8 лет (2015) наблюдений было установлено, что в незагрязненной почве сохранилась по-

Таблица 3

Численность микроорганизмов в слое 0-20 см агродерново-карбонатной почвы, КОЕ/г почвы, 2015 г.

Вариант	Pseudomonas	Rhodococcus	Xantomonas	Phytoptora	Rhizoctonia	Fusarium
Контроль	108	108	108	102	104	102
Нефть 5 л/м2	102	102	104	104	104	104
Нефть 5 л/м2 + Альбит	104	104	104	102	102	102
Нефть 10 л/м2	102	102	102	106	104	104
Нефть 10 л/м2 + Альбит	108	106	106	0	0	0
Нефть 20 л/м2	102	104	104	108	106	104
Нефть 20 л/м2 + Альбит	108	106	106	102	102	0

Последействие биопрепарата Альбит прослежено в увеличении доли бактериальной ассоциации. По дозам нефти 10 и 20 л/м2 КОЕ бактерий повышено, но все же оставалось меньшим, чем на контроле. Положительное последействие на структуру углеводородокисляющих микроорганизмов в агропочве можно рассматривать как экологически благоприятный эффект, т.к. среди микромицетов много фитопатогенных форм.

В России безопасной концентрацией нефтепродуктов в почвах и грунтах считается 1 г/кг [Герасимова и др., 2003; Трофимов, Прохоров, 2006; Водянова, 2013]. В наших исследованиях содержание углеводородов достигло этого уровня на 10-й год самоочищения почвы, загрязненной нефтью из расчета 5 л/м2, но благодаря биопрепарату безопасное состояние достигнуто уже на 8-й год после начала ремедиации. По большим дозам загрязнения безопасных концентраций в период наблюдений не установлено, однако на фоне биопрепарата количество остаточной нефти снизилось в 2–3 раза. Следует отметить, что в нефтезагрязненных почвах микромицетов больше, но и количество остаточной нефти выше относительно вариантов с вышенная биогенность с доминированием бактерий. На фоне нефти численность КОЕ микромице-тов остается большей, чем у бактерий (табл. 3). Доля микромицетов возрастала с увеличением дозы загрязнителя, за их счет общая численность КОЕ микроорганизмов осталась наибольшей на варианте 20 л/м2.

применением препарата Альбит. По-видимому, бактерии эффективнее микромицетов разлагают нефть, это особенно заметно на фоне стимулирования биопрепаратом, т.к. углеводороды разлагались с большей скоростью.

Бенз(а)пирен – наиболее распространенный представитель полициклических ароматических углеводородов, который обладает особенно высокой стойкостью в объектах окружающей среды, а также повышенной канцерогенностью и мутагенностью. Бенз(а)пирен относится к соединениям первого класса опасности, а его содержание во всех объектах экосистемы подлежит обязательному контролю [Jian, 2004; ISO 13877-2005; To-biszewski, Namiesnik, 2012]. К сожалению, устойчивость этого супертоксиканта была подтверждена и в нашем эксперименте (табл. 4). Загрязнение повысило количество бенз(а)пирена в слое 0–20 см в 16–20 раз и при максимальной дозе нефти достигло ПДК. В дальнейшем его количество слабо менялось, а предельно допустимый уровень сохранился и через 8 лет. На варианте 5 л/м2 через 10 лет количество этого канцерогена составило 0.45 ПДК.

Таблица 4

Динамика содержания углеводородов и бенз(а)пирена в нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почве в процессе ремедиации (слой 0–20 см)

Вариант	Углеводороды, %				Бенз(а)пирен, мг/кг почвы
	200 7	201 0	201 5	201 7	2007	2010	2015	2017
Контроль	0	0	0	-	0.87 · 10-3	0.88 · 10-3	0.86 · 10-3	-
Нефть 5 л / м2	5	3.0	1.2	1.0	16.88 · 103	15.76 · 103	15.96 · 103	8.95 · 103
Нефть 5 л / м2 + Альбит	2.5	1.3	0.8	-	3.43 · 10-3	3.22 · 10-3	2.12 · 10-3	-
Нефть 10 л / м2	10	6.0	4.0	-	18.82 · 10-3	17.79 · 10-3	17.82 · 10-3	-
Нефть 10 л / м2 + Альбит	6	4.0	2.0	-	4.65 · 10-3	4.15 · 10-3	3.25 · 10-3	-
Нефть 20 л / м2	20	17.0	12.0	-	19.96 · 10-3	19.93 · 10-3	19.86 · 10-3	-
Нефть 20 л / м2 + Альбит	9.1	6.11	4.33	-	4.82 · 10-3	4.72 · 10-3	4.22 · 10-3	-

Примечания: « - » – отсутствие данных, ПДК бенз(а)пирена – 0.02 мг/кг почвы (ГН 2.1.7.2041-06).

На фоне биологической очистки почвы с применением биопрепарата в короткий период (за месяц) его количество снизилось в 5 раз (0.15–0.25 ПДК), но в последующем этот процесс значительно затормозился. На 8-й год эксперимента в почве содержалось 2-4 x 10 -3 мг/кг бенз(а)пирена (0.1-0.2 ПДК).

Заключение

В результате 8 лет исследований установлено, что в верхнем слое нефтезагрязненной агродерно-во-карбонатной почвы общая численность КОЕ исследуемых микроорганизмов и численность бактерий были понижены, одновременно в составе биоты возросла доля микромицетов. На фоне применения биопрепарата Альбит в нефтезагрязненной почве во все годы повышена численность бактерий, однако, и в конце периода наблюдений она оставалась ниже контрольного уровня.

В процессе самовосстановления почвы на варианте с меньшей дозой нефти (5 л/м2) содержание углеводородов достигло допустимой концентрации, но по вариантам с большими дозами (10 и 20 л/м2) их количество оставалось высоким – 4 и 12 ПДК. На фоне внесения биопрепарата во все годы наблюдений количество углеводородов было ниже в 2 и более раз. При меньшем загрязнении на 3-й год после начала ремедиации их содержание становилось ниже допустимой концентрации. При высоком нефтезагрязнении для успешного восстановления почв, по-видимому, необходимо не только однократное внесение биопрепарата, но и дальнейшая поддержка активности углеводородокис-ляющих микроорганизмов, в том числе, путем рыхления.

Количество бенз(а)пирена на варианте с наибольшей загрязненностью почвы достигало ПДК. Применение биопрепарата существенно ускорило разложение бенз(а)пирена; без его внесения со- держание канцерогена в почве снизилось малозначительно.

Таким образом, в процессе ремедиации нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы на фоне применения биопрепарата Альбит повысилась численность бактерий, отмечено ускоренное разложение углеводородов и бенз(а)пирена.