Динамика изменений большеберцового нерва при удлинении голени собак автодистрактором

К настоящему времени в специальной литературе накопилось значительное количество фактов, свидетельствующих о высокой чувствительности периферической нервной системы к различным экспериментальным воздействиям [7, 10, 12]. Морфологическое описание берцовых нервов в условиях дистракционного остеосинтеза было предметом специальных исследований [3, 6, 8]. По мере разработки новых методических подходов возрастает интерес к изучению количественных показателей периферических нервов, отражающих полноту их функционального и морфологического

МАТЕРИАЛ

Исследовали большеберцовые нервы 14 взрослых беспородных собак, которым после закрытой флексионной остеоклазии удлиняли восстановления после различных видов повреждений [4, 9, 11] и объективно характеризующих направленность и временные изменения их морфофункционального состояния при удлинении конечности в высокодробных режимах. Учитывая отсутствие таких данных, мы поставили перед собой задачу изучить в эксперименте на животных динамику изменения гистоморфометрических показателей большеберцового нерва на этапах удлинения голени высокодробными автоматическими дистракторами.

И МЕТОДЫ голень на 15% в течение 28 дней аппаратом Илизарова с автоматическим приводом, обеспечивающим дистракцию костных фрагментов с суточной скоростью 1,0 мм и шагом 0,017 мм. Животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов в конце дистракции (n=7), через месяц фиксации (n=3) и через месяц после снятия аппарата (n=4). Большеберцовые нервы контралатеральной (условный контроль) и опытной конечностей на уровне средней 1/3 голени закрепляли на твердой основе и иссекали для морфологического исследования. Проксимальный и дистальный концы иссеченных фрагментов нервов замораживали в жидком азоте и на микротоме-криостате МК-25 ТУ 64-1-856-78 при t = -18°С разлагали на тотальные поперечные срезы толщиной 7-10 мкм. В них кальцийкобальтовым методом [З. Лойда, 1982] выявляли активность миозиновой АТФ-азы. Остальной материал фиксировали в смеси 2% растворов глутарового и параформальдегидов на фосфатном буфере (рН 7,4), постфиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия, дегидратировали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в эпоксидные смолы. Поперечные полутонкие (0,5-1,0 мкм) срезы большой площади получали на ультратоме “Nova” фирмы LKB (Швеция), монтировали на заранее целлоидинированные предметные стекла и окрашивали раствором метиленового синего и основного фуксина.

Препараты изучали в большом исследовательском фотомикроскопе и стереомикроскопе фирмы “Opton”, оснащенных аппаратнопрограммным комплексом “DiaMorph”, что позволило оцифровывать изображения в ходе исследования. В цифровых изображениях гистохимических препаратов в программе “MEDIAS” (“DiaMorph”, Россия) измеряли общую площадь поперечного сечения нерва, суммарную площадь пучков нервных волокон вместе с окружающим их периневрием. Полученные значения сопоставляли по критерию Манна-Уитни (двусторонний вариант).

В цифровых изображениях полутонких срезов методом точко-счетной объемометрии рассчитывали относительный объем нервных волокон (V Vnf ), эндоневрия (V Vendo ) [1]. Определяли численные плотности мякотных нервных волокон (N Amnf ), их реактивно измененных форм (Na dmnf ) и долю последних в общем объеме выборки. Анализ цифрового материала проводили методами непараметрической статистики в программе Microsoft Excel 97 по W-критерию Вил-коксона для независимых выборок (статистические тесты запрограммированы И.П. Гайдыше-вым [2] и помещены в динамически подключаемую библиотеку).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Через 28 дней удлинения на дистальном уровне общая площадь поперечного сечения большеберцового нерва оперированной конечности и суммарная площадь пучков нервных волокон в 1,5 раза меньше, чем на контралатеральной стороне (рис. 1). На проксимальном уровне достоверные отличия по этому параметру отсутствуют (p>0,05).

Мякотные нервные волокна не обнаруживают патологических изменений, вместе с тем встречаются отдельные проводники крупного калибра с признаками реактивно-деструктивных изменений в виде вакуолизации аксона и дезинтеграции миелина, составляющие в среднем 1,78% в нервах опытной и 0,47% – контралатеральной конечностей.

Рис. 1. Большеберцовый нерв, дистальный уровень, дистракция 28 дней: а) оперированная, б) контралатеральная конечности; 1-6 – пучки нервных волокон, П – периневрий, А – артерия. Криостатные срезы, реакция на миозиновую АТФ-азу. Об.- 1, ок.- 10х. Эксперимент № 2084

Объемная доля нейральных элементов в нерве оперированной конечности на 14,5% ниже, чем в контралатеральном нерве (p < 0,05) (табл. 1), а доля эндоневрия соответственно выше. Численная плотность мякотных волокон в удлинённом нерве незначительно выше, чем в контралатеральном (p>0,05). Как на оперированной, так и на контралатеральной стороне встречаются тонкие миелинизирующиеся ремаковские волокна малого калибра с разной степенью зрелости мякотной оболочки.

К концу дистракции в большинстве наблюдений животные пользовались удлиненной конечностью, приступая на нее в стойке или при ходьбе. Положение стопы, как правило, было близко к физиологическому.

В конце фиксации площадь поперечного сечения нерва оперированной стороны меньше (в среднем в 1,2 раза) на обоих уровнях. Соответственно уменьшена и суммарная площадь пучков.

Объёмная плотность нервных волокон незначительно (на 2,2%) ниже, а численная плотность мякотных волокон в удлинённом нерве на 18% выше (p < 0,05), чем на контралатеральной стороне. Как и на предыдущем сроке эксперимента, в нерве оперированной конечности содержатся незрелые миелинизирующиеся волокна.

На стороне удлинения продолжают встречаться единичные (0,45%) реактивно-измененные мякотные волокна, а в нервах контралатеральной конечности (рис. 2) количество их возрастает до 1,09% (табл. 1). При этом численная плотность деструктивно изменённых мякотных нервных волокон и их процентная доля в общем объёме вы- борки по сравнению с контралатеральной стороной уменьшается примерно в 2 раза.

Объемная плотность эндоневрия большеберцового нерва опытной конечности, как и на предыдущем сроке, превышает контрольные значения на 8% при p < 0,05 (табл. 1).

Нужно отметить, что в период фиксации все собаки активно нагружали оперированную конечность, амплитуда движений в коленном суставе приближалась к норме и составляла 90-100º (норма 100-110º), в голеностопном суставе сохранялось ограничение амплитуды движений – 50-60º.

Через месяц после снятия аппарата у двух животных общая площадь нерва и суммарная площадь пучков нервных волокон на опытной конечности в 1,3 раза больше (p < 0,05), чем на контралатеральной. У остальных двух общая площадь нерва достоверно не отличается от контроля, а суммарная площадь пучков меньше в 1,2 раза (p < 0,05) .

Объёмная плотность нервных волокон на этом сроке наблюдения оказывается выше на оперированной стороне (в среднем на 5,5%). Численная плотность мякотных волокон ниже, однако это различие статистически незначимо. Процентное содержание мякотных нервных волокон с признаками реактивно-деструктивных изменений на опытной и контралатеральной сторонах составляет 0,54 и 0,92% соответственно.

Объемная плотность внутрипучковой соединительной ткани понижена на 13% по сравне- нию с контролем, при p<0,05 (табл. 1).

Таблица 1

Морфометрические характеристики большеберцовых нервов собак на этапах эксперимента

Сроки	Число опытов	Конечность	Vv nf	Vv endo	Na mnf	Na dmnf	Доля (%) dmnf
Д - 28	7	оперированная	50,6*	49,4*	22,5	0,4*	1,78
		контралатеральная	65,1	34,9	21,4	0,1	0,47
Ф - 30	3	оперированная	72,2*	27,8*	22,2 *	0,1*	0,45
		контралатеральная	74,4	25,6	18,3	0,2	1,09
БА - 30	4	оперированная	62,6*	37,4*	18,6	0,1*	0,54
		контралатеральная	57,1	42,9	21,7	0,2	0,92

* - различия между опытной и контралатеральной конечностью достоверны по W – критерию Вилкоксона для независимых выборок (p < 0,05).

Рис. 2. Левый большеберцовый нерв. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. 40, ок. 12,5х. Эксперимент № 2210, дистракция 28, фиксация 30 дней. Стрелки – реактивноизмененные крупные мякотные нервные волокна

После снятия аппарата каких-либо ограничений функции оперированной конечности клинически выявлено не было.

Полученные результаты количественного исследования большеберцового нерва на разных этапах удлинения голени свидетельствуют о том, что в конце дистракции на оперированной стороне уменьшение общей площади поперечного сечения нерва и суммарной площади пучков нервных волокон наблюдается только на дистальном уровне средней 1/3 голени. Данный факт можно объяснить тем, что большеберцовый нерв связан с окружающими тканями в области голеностопного (скакательного) сустава и при удлинении голени его дистальный участок испытывает наибольшее растяжение. К концу периода фиксации нерв становится равномерно, но незначительно истонченным в сравнении с контралатеральной стороной, а через 30 дней после снятия аппарата площадь его поперечного сечения у двух животных восстанавливается, у двух же достоверно превышает контрольные значения.

Исследование показывает отсутствие каких-либо морфологических признаков тракционного повреждения нерва, что согласуется с данными K. Ikeda, K. Tomita, S. Tanaka [11], которые при удлинении бедра кролика с суточной скоростью 0,8-2,0-4,0 мм за 1 прием ни в одной из экспериментальных групп не обнаружили явлений валлеровской дегенерации волокон седалищного нерва. Нами отмечено развитие незначительных реактивных изменений толстых мякотных нервных волокон, которые, по мнению многих авторов [5, 6, 8], являются наиболее чувствительными к механическим воздействиям. В конце дистракции численная плотность реактивно- изменённых мякотных нервных волокон в четыре раза выше в нерве оперированной конечности, чем в контралатеральной, но на этапе фиксации и после снятия аппарата этот параметр в два раза выше в контралатеральном нерве. Их доля в общем объёме выборки меняется аналогично. Это свидетельствует не только об уменьшении действия факторов, влияющих на нервные волокна, но и о некотором приросте численности волокон с нормальной структурой.

Изменения соотношений площадей поперечного сечения нерва, суммарной площади его пучков, объёмной плотности нервных волокон и эн-доневрия, а также численной плотности мякотных волокон отражают различные процессы, протекающие на этапах эксперимента. Мы предполагаем, что это прежде всего результат перераспределения эндоневральной жидкости, изменения аксоплазматического тока, перекалибровки мякотных нервных волокон, новообразования и дифференцировки нервных проводников, а также морфогенетических процессов в оболочках нерва. Увеличение объёмной доли нейральных элементов и уменьшение доли изменённых нервных волокон в нерве оперированной конечности по сравнению с контралатеральным к концу эксперимента свидетельствует о восстановлении аксонального транспорта в зрелых волокнах и образовании новых нервных проводников.

Полученные в результате проведённого исследования данные об отсутствии морфологических признаков тракционного повреждения нерва указывают на малую травматичность оперативного вмешательства и удлинения конечности, а также о структурно-функциональной адаптации нейронов к увеличению длины конечности.