Динамика эффективности фиксации CO 2 штаммом Bracteacoccus minor при различной доступности азота

Увеличение объемов использования ископаемой энергии на основе углерода, уничтожение лесов и другие изменения в землепользовании привели к еще большему количеству отходов в виде парниковых газов, а также к снижению способности планеты поглощать их [White, 2012]. Проблема эмиссии углекислого газа в атмосферу приобретает все более глобальные масштабы [Li et al., 2023], что связано в первую очередь с индустриализацией, увеличением численности населения и использованием ископаемой энергии [White, 2012]. Накопление парниковых газов имеет ряд негативных экологических последствий, одно из которых – глобальное потепление [Venkata Mohan et al., 2016; Zhu et al., 2016; Sangeetha et al., 2022], а также ряд сопутствующих проблем, что в комплексе стало серьезной угрозой для экологической устойчивости и безопасности человечества в целом [Ma et al., 2022]. В связи с этим все более актуальной становится стратегия нулевого углеродного баланса [Ma et al., 2022]. По вопросам изменения климата и снижения выбросов парниковых газов разработан ряд регламентирующих документов международного статуса, в которых Российская Федерация является стороной взаимодействия [Cherepovitsyna, Dorozhkina, Kostyleva, 2023].

Большие перспективы по снижению эмиссии углекислого газа может иметь биосеквестрация. Она предполагает возможность снижения эмиссии углекислого газа путем восстановления различного рода экосистем или введения в эксплуатацию не возделываемых территорий, акваторий и др. Однако данные мероприятия обычно продолжительны во времени, а для лесных экосистем требуют десятилетий. Ввиду данных ограничений микроводоросли выглядят как довольно перспективный объект биосеквестрации, а их использование в данном контексте становится все шире [Cheah et al., 2015; Zhu et al., 2016; Ma et al., 2022; Zhao et al., 2022; Li et al., 2023]. Известен положительный опыт применения некоторых штаммов микроводорослей для снижения выбросов CO 2 с дымовыми газами. Поглощение CO 2 клетками водорослей усиливается при синтезе вторичных метаболитов [Venkata Mohan et al., 2016]. Спектр синтезируемых микроводорослями метаболитов очень широк [Barkia, Saari, Manning, 2019; Dolganyuk et al., 2020; Coulombier, Jauffrais, Lebouvier, 2021; Ramos-Romero et al., 2021]. Объемы биомассы микроводорослей, выращиваемой для целей биотехнологических производств, постоянно растут.

Широко распространенной практикой активизации биосинтеза ценных метаболитов является культивирование в стрессовых условиях, в том числе выращивание в средах с ограниченной доступностью азота [Rios et al., 2015; Mudimu et al., 2017; Zhang et al., 2018; Janssen, Wijffels, Barbosa, 2019; Chen et al., 2022; Şirin, Serdar, 2024]. И хотя накопление вторичных метаболитов сопряжено с усилением поглощения CO 2 , сами процессы биосеквестрации при ограничении азота исследованы мало [Farooq, 2022]. Однако они представляют значительный интерес с точки зрения достижения нулевого углеродного баланса.

В качестве биотехнологических объектов интенсивно исследуются представители рода Bracteacoccus Tereg, что связано с их способностью синтезировать при определенных условиях культивирования каротиноиды, липиды и ценные жирные кислоты [Ratha et al., 2013; Minyuk, Chelebieva, Chubchikova, 2014; Mamaeva et al., 2018; Maltsev et al., 2020; Chekanov et al., 2022; Lukavský et al., 2022; Malik et al., 2022]. В этом аспекте один из представителей – Bracteacoccus minor (Chodat) Petrova исследован довольно слабо, хотя является космополитным видом и довольно широко распространен. Эффективность поглощения CO 2 данным видом пока не изучалась, хотя его широкое распространение в сочетании с биотехнологическим потенциалом может стать основой разработки проектов, объединяющих в себе решение проблем секвестрации углекислого газа и получения ценных метаболитов в промышленных масштабах.

Цель – изучить динамику биофиксации CO 2 штаммом Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) в условиях различной доступности азотного питания.

Материалы и методы исследований

Выделенный из почвы штамм Bracteacoccus minor MZ-Ch31 (насаждение Robinia pseudoacacia L., парк им. Горького, г. Мелитополь, Россия), выращивали на стандартной среде BBM (Bischoff and Bold, 1963). Штамм в культуре поддерживается при 15±2°C в пробирках, освещенных белыми диодами с интенсивностью света 120 Лк и режимом освещения 16:8 ч (свет/темнота) на среде BBM. Для эксперимента клетки иннокулировали в 150 мл свежей среды BBM. При наступлении экспоненциальной фазы роста (через 5 дней) эту культуру использовали для постановки эксперимента. В качестве реакторов использовались плоскодонные колбы объемом 250 мл с герметичными крышками и системой обеспечения постоянства состава газовоздушной смеси в колбе. Культуры аэрировали воздухом с помощью аквариумного компрессора Hailea ACO-308 (Hailea, China). Воздух подавали через стеклянную трубку с внутренним диаметром 4 мм со скоростью 0.1 л мин^-1. Для предотвращения бактериального загрязнения культуры использовали бактериальный вентиляционный фильтр (GSV, Italy) диаметром 40 мм, который устанавливался в разрыв между компрессором и стеклянной трубкой. Это позволило поддерживать культуру в альгологически чистом состоянии. Выращивание штамма проводили в стандартных условиях: интенсивность света – 5000 Лк; режим освещения – 16:8 ч (свет/ темнота); температура окружающей среды – 20±1°С. Начальная концентрация – 2.89×10⁵ клеток мл^-1.

Для постановки эксперимента использовали стандартную и модифицированную по содержанию азота среду BBM. Исследовали 4 варианта питательной среды, обозначенные как группа-1, группа-2, группа-3, группа-4. Группы отличались между собой содержанием в питательной среде общего азота (N) в форме нитратов (NO 3 ^–). Концентрации подбирались в соответствии с содержанием N в широко применяемых средах культивирования (3N BBM, BBM, F, F2). Соответственно концентрация азота в группах составляла: группа-1 – 0.124 г л^-1; группа-2 – 0.04 г л^-1; группа-3 – 0.025 г л^-1; группа-4 – 0.012 г л^-1. Группа-2 выступала в качестве контрольной, т.к. имела стандартное для среды BBM содержание азота.

Плотность биомассы (B) определяли гравиметрически, путем выдерживания 1 мл биомассы в сушильном шкафу на протяжении 6 часов при 120°С и последующим взвешиванием сухого остатка.

Рост микроводорослей оценивали путем измерения сухого веса (СВ). Измеренный сухой вес выражали в г л ^{- 1} . Объемная продуктивность биомассы (P) рассчитывалась по формуле в соответствии с источником [Morais, Costa, 2007]:

Р (г СВ л-1 день-1) = У， где X1 – сухой вес (г СВ л-1) во время t1 (день), и X2 – сухой вес (г СВ л-1) во время t2 (день).

Биофиксацию СО 2 (F) рассчитывали на продуктивность биомассы (Р) по уравнению [Morais, Costa, 2007] с уточнениями:

F — pQ м— )

, где Р – продуктивность биомассы (г СВ л^-1 день^-1), C C – содержание С в биомассе (%), M (CO 2 ), (MC) – молярная масса CO 2 и С соответственно.

Содержание углерода в биомассе Bracteacoccus minor принимали равным 48.5%, что соответствует среднему значению для различных зеленых микроводорослей [Harwati, Willke, Vorlop, 2018].

Содержания хлорофиллов -a, -b (Chl a, b) определяли по методу [Yang et al., 1998]. Экстракцию пигментов из микроводорослей проводили 80.0% ацетоном. Для этого 10 мг отделенных от среды центрифугированием (10 мин. при 3 000 об/мин-1, 530 g) клеток подвергали 3-кратному замораживанию- размораживанию с целью разрушения клеточных оболочек. После чего добавляли 4 мл ацетона с целью создания соотношения биоматериал-экстрагент 1:40 (масса: объем) и дополнительно гомогенизировали биомассу путем растирания с кварцевым песком. Полученную смесь герметично закрывали и оставляли на 24 часа при температуре 25°С в темном месте для полной экстракции пигментов. Далее ацетоновый экстракт отделяли от осадка центрифугированием при 10 000 об/мин-1 (6 000 g) и температуре 4°С на протяжении 10 мин. Анализировали интенсивность поглощения экстракта пигментов на спектрофотометре Ulab 102 (China) при длинах волн: 663.6; 646.6 нм, что соответствует максимуму поглощения для Chl a и Chl b. Расчеты проводили по следующей формуле:

.

Содержание суммы хлорофиллов выражали в мг г-1 СВ путем преобразования расчетных единиц µг мл-1 с учетом коэффициента разведения и навески сухой биомассы.

Все измерения проводились минимум в трех повторностях, на графиках и в таблицах приведены средние величины и ошибки средней которые высчитывали по ANOVA с применением встроенных функций программы Microsoft Excel (v. 1903). Достоверными считали различия при p≤0.05. Корреляционный анализ проводили с применением встроенной функции попарных корреляций Пирсона в программном обеспечении IBM SPSS Statistics v. 27. Достоверными считали корреляции при уровне значимости p≤0.10.

Результаты

В ходе эксперимента плотность биомассы Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) в контрольной группе (группа-2) на 15 сутки культивирования достигла 0.77 г СВ л^-1, максимальный прирост биомассы наблюдался между 4–5 и 5–8 сутками (0.11 и 0.14 г СВ л^-1) (рис. 1б). Более низкое содержание доступного азота в питательной среде (3 и 4 группа) сопровождалось уменьшением накопления биомассы штаммом и удлинением lag-фазы (рис. 1в, 1г). Наиболее сильно снижалась концентрация биомассы при минимальной концентрации азота в среде культивирования (группа-4) и составляла – 0.57 г СВ л^-1, при этом lag-фаза была максимальной и длилась 8 суток (рис. 1г).

Время культивирования, суток

Время культивиров ания, суток

Время культивирования, суток

-.SMH^OhLKd) qlooHaHXMABOdu

Время культивиров ания, суток

Рис. 1. Скорость роста (B), продуктивность (P) и биофиксация CO 2 (F) Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) при культивировании в различных вариантах эксперимента:

а) – 0.124; б) – 0.04; в) – 0.025; г) – 0.012 г л-1. * – разница достоверна относительно предыдущего значения на уровне p≤0.05

[Growth rate (B), productivity (P) and bio-fixation of CO 2 (F) Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) during cultivation in various experimental variants:

• а) – 0.124; б) – 0.04; в) – 0.025; г) – 0.012 g L^-1. Note: * – the difference is significant relative to the previous value at the p≤0.05 level]

В группе-4 между 11–12 сутками культивирования прирост биомассы не был отмечен, а максимальный достоверный прирост (0.13 г СВ л-1; p≤0.05) установлен между 5 и 8 сутками. Стоит отметить, что по мере снижения концентрации азота достоверные приросты биомассы смещаются на более поздние сроки.

Ограничение доступности азота в среде лимитирует рост и деление клеток, приводит к удлинению lag-фазы, сокращению логарифмической фазы и выходу на стационарную стадию роста культуры раньше относительно контроля. При повышении концентрации азота до 0.124 г л-1 (группа-1), что в 3.1 раза больше относительно стандартной BBM, отмечено наибольшее накопление биомассы среди всех исследованных экспериментальных групп. Максимальный прирост биомассы был между 4–5 сутками и составлял 0.30 г СВ л-1 (p≤0.05). Также в группе-1 установлена максимальная в эксперименте плотность биомассы 1.30 г СВ л-1 и самая короткая lag-фаза – 3 суток. Следует отметить, что плотность биомассы имела прямую зависимость от содержания азота в среде культивирования, что подтверждено коэффициентом корреляции (r=1.0; p≤0.05).

.HHIX3ъeOu j - (巴 ^оо KHIIEJXHtHg

Время культивирования, суток

Рис. 2. Биофиксация CO 2 (F) Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) при культивировании в различных вариантах эксперимента:

концентрация азота в среде: F1 – 0.124; F2 – 0.04; F3 – 0.025; F4 – 0.012 г л-1. R2 – величина достоверности аппроксимации (полиноминальная линия тренда)

[Bio-fixation of CO 2 (F) Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) during cultivation in various experimental variants: Nitrogen concentration in medium: F1 – 0.124; F2 – 0.04; F3 – 0.025; F4 – 0.012 g L^-1. Note: R² – approximation accuracy (polynomial trend line)]

Максимальная среди исследованных групп продуктивность биомассы установлена для группы-1 с наибольшим содержанием азота в питательной среде. Она достигала максимального значения (0.3 г СВ л-1сутки-1) на 5 день культивирования с дальнейшим снижением до минимума в конце эксперимента. В стандартной среде BBM (группа-2) максимум продуктивности составлял 0.11 г СВ л-1 сутки-1, так же, как и в группе-3. В эксперименте с минимальным количеством азота в среде (группа-4) максимум продуктивности приходился на 10 сутки – 0.08 г СВ л-1 сутки-1.

Стоит отметить, что при культивировании штамма в экспериментальных группах 1 – 3 наблюдался рост продуктивности с двумя пиками, в группе-1 – на 5 и 9 сутки, в группе-2 – на 5 и 10 сутки. Далее происходило резкое снижение продуктивности, связанное, очевидно, с нарастающим истощением питательных компонентов в среде и замедлением роста и деления клеток. В группе-4 пик продуктивности приходится на 11 сутки с дальнейшим резким снижением.

Ежедневные показатели биофиксации CO 2 в контрольной группе (группа-2) снижались по мере старения культуры (рис. 2). Максимальная эффективность поглощения СО 2 штаммом в стандартной среде BBM (группа-2) наблюдалась на 10 сутки и составляла 0.2 г CO 2 л^-1 сутки^-1, а минимальная – на 2 и 15 сутки культивирования, что связано с низким приростом биомассы. В группе-1 максимум фиксации CO 2 составлял 0.53 г CO 2 л^-1 на 5 сутки роста. Это самый высокий показатель в эксперименте (рис. 1а). В группе-4 максимальное поглощение было значительно ниже – всего 0.14 г CO 2 л^-1 сутки^-1 и отмечено на 11 сутки культивирования.

Средняя скорость биофиксации углекислого газа за весь период культивирования снижалась с уменьшением концентрации азота в питательной среде (r=1.0; p≤0.05) (табл. 1). В группе-4 она была наименьшей. Также минимальным в этой группе было и общее количество утилизированного за 14 суток эксперимента CO 2 . Относительно контрольной группы данные показатели были меньше в 1.6 раз. Повышение концентрации азота в питательной среде приводит к повышению как средней скорости биофиксации CO 2, так и общего количества поглощенного углекислого газа почти в 2 раза относительно стандартной среды BBM.

Таблица 1

Биомасса и биофиксация CO2 Bracteacoccus minor MZ-Ch31 в различных вариантах эксперимента (M±SD; n = 3)

[Biomass and bio-fixation of CO2 Bracteacoccus minor MZ-Ch31 in various experimental variants (M±SD; n = 3)]

Варианты эксперимента	Биомасса на 14 сутки, г СВ л-1	Содержание хлорофиллов ( a, b ) на 14 сутки, мг г-1 СВ	Средняя скорость биофиксации CO 2 за 14 суток, г CO 2 л-1 день-1	Утилизированный CO 2 за 14 суток, г л-1	Содержание азота в среде, мг л-1
Группа-1	1.3±0.03#	2.34±0.24*#	0.16	1.8±0.17#	0.124
Группа-2 (BBM)	0.77±0.17*	1.72±0.18*	0.08	0.93±0.06*	0.040
Группа-3	0.67±0.07	1.13±0.12*#	0.07	0.81±0.06	0.025
Группа-4	0.57±0.03#	0.58±0.07*#	0.05	0.58±0.05*#	0.012

Примечание. * – разница достоверна относительно предыдущей группы на уровне p≤0.05; # – разница достоверна относительно группы-2 (BBM) на уровне p≤0.05.

Содержание хлорофиллов ( a, b ) определяли в конце эксперимента на 14 сутки. Стоит отметить, что снижение концентрации азота в среде привело к уменьшению содержания хлорофиллов (r=1.000; p≤0.01). Результаты корреляционного анализа показали (табл. 2), что содержание хлорофиллов может быть одним из показателей секвестрационных характеристик штамма, так как для Bracteacoccus minor MZ-Ch31 установлена прямая (достоверная) корреляционная зависимость между концентрацией хлорофилла, параметрами биофиксации и утилизированного CO 2 . Это обусловлено тем, что фотосинтез сопровождается поглощением углекислого газа и является основным метаболическим шлюзом, обеспечивающим накопление прекурсоров для биосинтеза первичных и вторичных метаболитов, необходимых для роста и деления клеток.

Обсуждение

Скорость поглощения CO 2 для Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) хорошо коррелирует с ростом биомассы, поскольку более высокое поглощение CO 2 в фотоавтотрофных условиях приводит к высокой продуктивности биомассы. Такая же зависимость установлена для Chlorella sp. и, как предполагают авторы, заметное увеличение продуктивности биомассы может быть объяснено усиленной фотосинтетической активностью и функцией ключевых фотоавтотрофных ферментов [Butti, Venkata Mohan, 2018]. Скорость биофиксации углекислого газа у Bracteacoccus minor MZ-Ch31 имела прямую зависимость от концентрации хлорофиллов в клетке (r = 0.918; p≤0.10). Азотное голодание в качестве инструмента повышения биофиксации CO 2 неэффективно, поскольку приводит к снижению общего количества биомассы, а также количества хлорофиллов.

Таблица 2

Результаты корреляционного анализа [The results of the correlation analysis]

Показатели		B	Chl	F	CU	N
B	Корреляция Пирсона	1	0.918*	0.999***	0.999***	1.000***
	знач. (двухсторонняя)		0.082	0.001	0.001	<0.001
Chl	Корреляция Пирсона	0.918*	1	0.918*	0.923*	0.908*
	знач. (двухсторонняя)	0.082		0.082	0.077	0.092
F	Корреляция Пирсона	0.999***	0.918*	1	1.000***	0.998**
	знач. (двухсторонняя)	0.001	0.082		<0.001	0.002
CU	Корреляция Пирсона	0.999***	0.923*	1.000***	1	0.997**
	знач. (двухсторонняя)	0.001	0.077	0		0.003
N	Корреляция Пирсона	1.000***	0.908*	0.998**	0.997**	1
	знач. (двухсторонняя)	<0.001	0.092	0.002	0.003

Примечания: B – биомасса Bracteacoccus minor MZ-Ch31 на 14 сутки, г СВ л-1; Chl – содержание хлорофиллов (a, b) на 14 сутки, мг г-1 СВ; F – средняя скорость биофиксации CO2 за 14 суток, г CO2 л-1 день-1; CU – утилизированный CO2 за 14 суток, г л-1; N – содержание азота в питательной среде, мг л-1; n = 4. ^* – корреляция достоверна на уровне p≤0.10; ^** – корреляция достоверна на уровне p≤0.05; ^*** – корреляция достоверна на уровне p≤0.01.

Максимальная описанная на данный момент способность поглощать углекислый газ установлена для Chlorella vulgaris – от 3.45 г CO 2 л^-1 день^-1 до 6.24 г CO 2 л^-1 день^-1, Aphanothece microscopica Nageli – 5.44

г CO 2 л^-1 день^-1 [Fan et al., 2008; Ho et al., 2011]. Также высокие значения отмечены для Nannochloropsis gaditana – 1.7 г CO 2 л^-1 день^-1 [Adamczyk, Lasek, Skawińska, 2016], Synechocystis aquatilis SI-2 – 1.5 г CO 2 л^-1 день^-1 [Murakami, Ikenouchi, 1997]. В среднем биофиксация CO 2 для представителей микроводорослей различных филогенетических и экологических групп варьирует от 0.02 до 6.24 г CO 2 л^-1 день^-1 [Ho et al., 2011]. Большая вариативность данных может быть следствием как индивидуальных особенностей видов водорослей, так и условий культивирования, включая исходную концентрацию биомассы водорослей. Для Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) в условиях нашего эксперимента наибольшее поглощение углекислого газа было 0.53 г CO 2 л^-1 день^-1, среднее – 0.16 г CO 2 л^-1 день^-1. Дальнейшие исследования позволят получить более полные характеристики биофиксации CO 2 штаммом.

Заключение

Скорость биофиксации и общее количество поглощенного CO 2 Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) зависит от концентрации азота в питательной среде. Повышение доступности азота увеличивает среднюю скорость поглощения углекислого газа с 0.05 г CO 2 л^-1 сутки^-1 до 0.16 г CO 2 л^-1 сутки^-1. Максимум поглощения углекислого газа соответствовал 0.53 г CO 2 л^-1 сутки^-1 и был достигнут в момент выхода культуры с lag-фазы. Скорость биофиксации и количество поглощенного углекислого газа Bracteacoccus minor (MZ-Ch31) прямо зависит от концентрации биомассы (r= 0.999 и r= 0.999; p≤0.01) и хлорофиллов (r= 0.918 и 0.923; p≤0.10).