Динамика количества чувствительных и моторных нейронов, участвующих в регенерации седалищного нерва крысы после его перерезки

Введение. Одним из актуальных вопросов в современной медицине является вопрос о возможностях регенерации периферических нервов. Повреждения нервного ствола вызывают расстройства движений, чувствительности и вегетативно — трофические нарушения. Эффективность различных методов лечения остаётся недостаточной. Во многом это связано с недостатком сведений о динамике регенерации повреждённого нерва. Успех восстановления периферического нерва в определённой степени определяется выживаемостью после травмы нейронов, задействованных в его формировании. При этом сведения о динамике количества регенерирующих нейронов при повреждёнии нерва имеют принципиальное значение для его восстановления. Существует большое количество исследований, оценивающих выживаемость нейронов после повреждения седалищного нерва [1—5], но в них гибель нейронов оценивается по отношению к общему количеству нейронов в спинномозговом узле (СМУ) или в сегменте спинного мозга (ССМ). Однако известно, что в формировании седалищного нерва участвуют не все клетки СМУ и ССМ, а лишь определённые популяции нейронов [6-9]. Устойчивость клеток к повреждению в этих популяциях оценивалась немногими авторами [10-11]. Основой успешной регенерации периферических нервов является прорастание нервных волокон из проксимальной культи в дистальную. Известно, что только часть из выживающих нейронов данной популяции способны преодолеть место травмы [12]. Следует так же отметить, что работы, связанные с оценкой динамики количества нейронов, прорастающих в дистальную культю, а также их размерных групп, в литературе отсутствуют.

Цель исследования – изучить общее количество и соотношение размерных групп популяций чувствительных и моторных нейронов, способных преодолеть соединительнотканный рубец через 30, 90, 150 и 300 суток после перерезки седалищного нерва.

Материалы и методы. Исследования проведены на 27 белых беспородных самцах крыс массой 200-250г. Животные были разделены на контрольную (n=7) и экспериментальную (n=20) группы.

Для выявления популяции нейронов, формирующих седалищный нерв, был применён метод ретроградного маркирования нейронов флуоресцентным красителем Mini-Ruby — dextran, tetramethylrhodamine and biotin 10,000 MW, lysine fixable (Molecular Probes). Для этого у контрольных животных выделяли седалищный нерв, пересекали его на уровне верхней трети бедра и апплицировали красителем. После стандартной обработки материала [13] на криостате были приготовлены продольно ориентированные серийные срезы толщиной 25 мкм.

У экспериментальных животных маркирование нейронов производилось через 30, 90, 150 и 300 суток после перерезки седалищного нерва на уровне верхней трети бедра. Флуоресцентный краситель вводился в дистальную культю нерва. Материалом для гистологического исследования послужили СМУ L4, L5 и L6 и ССМ L4, L5 и L6, поскольку ранее проведённые исследования пока-

Таблица 1.

Динамика количества чувствительных и моторных нейронов, формирующих седалищный нерв в норме и после его перерезки.

Срок эксперимента, сутки Норма (n=7) 30 (n=5) 90 (n=5) 150 (n=5) 300 (n=5) Количество 2041,6 418,0 393,0 851,75 366,33 чувствительных ±445,2 ±106,53 ±121,28 ±208,84 ±54,08 нейронов 100% 20,47% 19,25% 41,72% 17,94% Количество 816,86 190,80 277,80 247,20 196,29 моторных ней- ±39,37 ±10,23 ±121,89 ±54,99 ±42,13 ронов 100% 23,36% 34,01% 30,26% 24,03% зали, что на этих сегментарных уровнях располагается абсолютное большинство чувствительных и моторных нейронов популяций, формирующих седалищный нерв [8-9]. Тотальный подсчёт маркированных нейронов на серийных срезах с одновременным определением их размерных групп производился на флуоресцентном микроскопе «Micros» МС 200 F с помощью окулярной сетки. Статистический анализ проведён с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Достоверность различий оценивалась с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney test. Достоверными считались результаты при р < 0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты подсчёта маркированных нейронов показали, что через 30-ть суток после перерезки седалищного нерва в реиннервации его дистальной культи участвуют 20,47 % нейронов СМУ от их общего количества в популяции в норме. Количество моторных нейронов к 30-м суткам составило 23,36 % от нормы (табл.1).

Ранее нами прово- проведено их подразделение на большие (75 мкм > d > 35 мкм) и мелкие (35 мкм > d) нейроны в соответствии с литературными данными [15-16]. Анализ размерных групп моторных нейронов показал, что в регенерации седалищного нерва участвуют 13,38 % больших нейронов и 173,38 % мелких нейронов от их количества в норме (рис.2).

Причиной увеличения количества мелких мотонейронов, по-видимому, являются значительные дегенеративные изменения перикарионов крупных мотонейронов после повреждения их аксонов, вследствие чего последние переходят в категорию мелких [17].

К 90-м суткам общее количество чувствительных нейронов по сравнению с предыдущим сроком существенно не изменилось и составило 19,25 % от количества нейронов в норме. Существуют данные о регенерации ветвей спинномозгового нерва на уровне Т13 [18], согласно которым в популяциях, участвующих в формировании данных ветвей на сроке 90 суток место травмы дилось подразделение популяции чувствительных нейронов данной популяции в зависимости от размера перикариона на большие (d > 35 мкм), средние (35 мкм > d > 20 мкм) и мелкие (20 мкм > d) [14]. Анализ размерных групп чувствительных нейронов показал, что на 30-е сутки в регенерации дистальной культи седалищного нерва принимают участие 5,58 % больших нейронов; 29,22 % средних нейронов; 11,68 % мелких нейронов от их количества в норме (рис.1).

На основании измерений профильных тел моторных нейронов было

Рис. 1. Изменение количества и размерных групп чувствительных нейронов, дендриты которых проросли в дистальную культю седалищного нерва

Рис. 2. Изменение количества и размерных групп моторных нейронов, аксоны которых проросли в дистальную культю седалищного нерва

составило 34,01 % от нормы. По сравнению с 30-ми сутками увеличение их количества статистически недостоверно. Количество больших моторных нейронов увеличилось в 2 раза по сравнению с 30ми сутками и составило 33,86 % от их количества в норме, а количество малых нейронов уменьшилось в 4 раза и составило 42,04 % от их количества в норме (рис.2).

Через 150 суток общее количество чувствительных нейронов, преодолевших область травмы, значительно увеличилось и составило 41,72 % от количества нейронов в норме. Увеличение количества преодолевают дендриты только 4 % нейронов. По-видимому, данное расхождение результатов связано с тем, что в работе И. Л. Ермолина повреждение нерва производилось значительно ближе к телам нейронов. Так же нами было выявлено, что на 90-е сутки в размерных группах произошло незначительное увеличение количества больших нейронов по сравнению с предыдущим сроком. Их количество составило 9,18 % от количества нейронов в норме. Количество средних и мелких нейронов незначительно уменьшилось и составило 25,69 % и 9,13 % соответственно (рис.1).

Общее количество моторных нейронов, проросших в дистальную культю, на данном сроке произошло во всех размерных группах нейронов. Количество больших нейронов по сравнению с предыдущим сроком увеличилось более чем в 4 раза и составило 37,92 % от нормы. Количество средних и мелких нейронов так же существенно увеличилось и составило соответственно 46,46 % и 19,75 % от их количества в норме (рис.1).

Общее количество регенерировавших моторных нейронов через 150 суток после перерезки нерва составило 30,26 % от нормы. Количество больших и мелких моторных нейронов по сравнению с предыдущим сроком практически не изменилось и составило 33,46 % и 42,86 % от их количества в норме соответственно (рис.2).

Рис. 3. Маркированные нейроны СМУ L4 в норме (а) и через 300 суток (б) после перерезки седалищного нерва. Окраска Mini-Ruby. Ув.100.

Таблица 2.

Процентное соотношение чувствительных нейронов в размерных группах в норме и после перерезки седалищного нерва.

Срок, сутки	Количество нейронов в размерной группе, %
	Большие	Средние	Мелкие	Общее количество
Норма	31,30	61,00	7,7	100
30	8,53	87,08	4,39	100
90	20,40	75,40	4,2	100
150	31,09	65,51	3,65	100
300	33,78	63,41	2,8	100

К 300-м суткам общее количество чувствительных нейронов уменьшилось до 17,94 % от нормы (рис.1,3). Количество больших и средних нейронов по сравнению с предыдущим сроком уменьшилось более чем наполовину и составило соответственно 16,12 % и 20,66 % от их количества в норме, количество же мелких нейронов уменьшилось более чем в пять раз и составило 3,82 % от нормы.

Общее количество регенерирующих моторных нейронов на данном сроке составило 24,03 % от нормы (рис.1,4). Количество больших нейронов по сравнению с предыдущим сроком уменьшилось на треть и составило 24,30 % от их количества в норме, а количество малых нейронов уменьшилось в два раза и составило 20,11 % от нормы.

Таким образом, общее количество регенерирующих чувствительных нейронов на сроках 30, 90 и 300 суток после операции достоверных отличий не имеет и составляет от 20,47 % до 17,94 %. При этом по мере увеличения послеоперационного срока происходит увеличение количества больших и уменьшение количества средних и мелких нейронов в популяции. К 300 суткам данные изменения в размерных группах больших и средних нейронов достигают статистически достоверных значений по сравнению с 30-ми сутками. Достоверность уменьшения количества мелких нейронов установить не удалось ввиду их малочисленности. Следует отметить значительное увеличение общего количества нейронов через 150 суток до 41,72 % от нормы по отношению к предыдущим срокам (рис.1), которое затронуло все размерные группы, но в большей степени большие нейроны. При оценке соотношения размерных групп нейронов в популяции СМУ выявлено его значительное изменение к 30-м суткам (табл. 2). К 300 суткам процентное соотношение размерных групп в популяции приближается к норме.

Общее количество моторных нейронов, преодолевающих область травмы, и участвующих в посттравматической регенерации седалищного нерва, достоверно не изменяется на всех сроках наблюдения и составляет от 23,36 % до 34,01 % от популяции в норме. Количественные показатели на 30-е и 300-е сутки отличаются менее чем на 1 %.

При оценке соотношения размерных групп нейронов в популяции ССМ выявлено, что на 30-е сутки эксперимента количество мелких мотонейронов достигает 46,33 % от выявленной популяции. В норме этот показатель составляет 6,35 %. Количество больших нейронов на 30-е сутки

Рис. 4. Маркированные нейроны спинного мозга на уровне L4 в норме (а) и через 300 суток (б) после перерезки седалищного нерва. Окраска Mini-Ruby. Ув.100.

Таблица 3.

Процентное соотношение моторных нейронов в размерных группах в норме и после перерезки седалищного нерва.

Срок, сутки Количество нейронов в размерной группе, % Большие Мелкие Общее количество Норма 93,65 6,35 100 30 53,67 46,33 100 90 92,15 7,85 100 150 91,50 8,50 100 300 94,69 5,31 100 эксперимента составляет 53,67 % от количества нейронов в популяции на данном сроке, а в норме их количество достигает 93,65 %. Начиная с 90-х суток, наблюдается восстановление соотношения больших и мелких мотонейронов, которое приближается к норме (табл. 3).

Таким образом, после перерезки седалищного нерва к 30-м суткам область травмы преодолевает лишь пятая часть как чувствительных, так и моторных нейронов от общего количества нейронов популяции. Изменение общего количества нейронов популяций СМУ и ССМ L4 – L6 на остальных экспериментальных сроках по сравнению с 30-ми сутками не имеет существенных колебаний. Исключением является значительное увеличение количества нейронов в популяции СМУ на 150-е сутки. К 300-м суткам показатели по чувствительным и моторным нейронам имеют тенденцию к уменьшению.