Динамика накопления микотоксинов в силосе на разных этапах хранения

Автор: Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Солдатова В.В., Никонов И.Н., Филиппова В.А., Бражник Е.А., Соколова О.Н.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Рубрика: Корма: проблема санитарного качества

Статья в выпуске: 6 т.49, 2014 года.

Бесплатный доступ

Присутствие в сырье микотоксинов - продуктов жизнедеятельности плесневых грибов представляет серьезную проблему во всем мире. Вследствие неправильной заготовки силоса происходит его загрязнение микотоксинами. На сегодняшний день практически отсутствуют сведения по их накоплению в сочных кормах в процессе силосования, а также остается невыясненным вопрос о способах, позволяющих предотвратить или снизить контаминацию кормов микотоксинами. Нами впервые в России изучена динамика накопления микотоксинов в силосе на разных этапах хранения. С этой целью в лабораторном эксперименте мы определили содержание микотоксинов (афлатоксинов, охратоксина А, Т-2 токсина, зеараленона и дезоксиниваленола) в исходном кормовом растительном сырье, оценили динамику этих показателей на разных этапах силосования ежи сборной Dactylis glomerata L., а также исследовали влияние биологических заквасок для силосования кормов биотроф и биотроф-111 (ООО «Биотроф+», г. Санкт-Петербург) и химических консервантов AIV 3 Plus или AIV 2000 Plus («KEMIRA OYJ», Финляндия) на снижение количества токсичных грибных метаболитов. Анализ микотоксинов в образцах проводили с использованием иммуноферментного метода (AgraQuant TM, «Romer Labs, Inc.», Австрия). Установлено, что «полевые» грибы начинают продуцировать микотоксины еще в период вегетации растений, и этот процесс активно продолжается в течение всего срока хранения силоса. Использование биологических заквасок позволило сдерживать накопление микотоксинов по сравнению с контролем без добавок. В конце срока хранения силоса в вариантах с применением заквасок биотроф и биотроф-111 количество афлатоксинов было ниже контроля соответственно на 17,7 и 9,1 %, охратоксина А - на 21,4 и 34,9 %, Т-2 токсина - на 20,1 и 32,8 %, зеараленона - на 17,7 и 10,4 % и дезоксиниваленола - на 0,8 и 55,8 %. Поскольку в России в настоящее время ПДК микотоксинов для силоса не установлены, для сравнения мы использовали величину нормированных ПДК микотоксинов для фуражного зерна овса, пшеницы и ячменя как злаковых культур, по таксономической принадлежности близких к многолетним травам, к которым относится ежа сборная. В отличие от овса, пшеницы и ячменя кукуруза, будучи злаковым растением, в Северо-Западном регионе России традиционной кормовой культурой не считается. Наибольшим эффектом сдерживания накопления микотоксинов обладала закваска на основе бацилл Bacillus subtilis. Использование химического консерванта приводило к некоторому снижению содержания отдельных микотоксинов по сравнению с контролем, однако токсичность силоса, за которую мы принимали суммарное превышение полученных показателей над референтными значениями по всем проанализированным микотоксинам относительно такового в варианте с применением химического консерванта была высокой и значительно превышала контроль во второй половине срока хранения. Известно, что в результате резкого изменения условий окружающей среды продукция микотоксинов у микроскопических грибов усиливается. В нашем эксперименте воздействие химического консерванта могло послужить стрессовым фактором, спровоцировавшим активный синтез микотоксинов.

Еще

Микотоксины, силос, биологическая закваска для силосования, химический консервант для силосования

Короткий адрес: https://sciup.org/142133549

IDR: 142133549   |   DOI: 10.15389/agrobiology.2014.6.123rus

Текст научной статьи Динамика накопления микотоксинов в силосе на разных этапах хранения

Силос — один из основных компонентов рациона крупного рогатого скота. В результате использования некачественного силоса животные испытывают дефицит питательных веществ, что непременно сказывается на их продуктивности, здоровье и сдерживает увеличение рентабельности производства. Проблемы, связанные с неполноценным кормлением, сопряжены в первую очередь с несоблюдением технологий выращивания и хранения кормового растительного сырья. Как известно, вследствие неправильной заготовки силоса, помимо ухудшения биохимических показа-

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда по научному проекту «Выявление биоразнообразия и трофического статуса микробиоты кормовых культур в связи с созданием качественных и биологически безопасных кормов» № 14-16-00114.

телей его качества, происходит загрязнение микотоксинами — продуктами жизнедеятельности плесневых грибов (1).

Снижение содержания микотоксинов в сырье составляет серьезную проблему, решение которой ищут специалисты во всем мире, поскольку поступление микотоксинов в организм с кормами вызывает микотоксикозы — заболевания, при которых снижается продуктивность, ухудшаются репродуктивные качества и иммунный статус животных (2). В малых дозах микотоксины приводят к уменьшению продуктивности и прироста живой массы, создают благоприятные условия для развития многих инфекционных заболеваний. Отдаленные последствия действия микотоксинов проявляются в виде иммунодепрессивных, канцерогенных, мутагенных, аллергенных, нейротоксичных и тератогенных эффектов, а также в подавлении воспроизводительной функции. К тому же в зараженных кормах микотоксины, как правило, находятся в сочетании, взаимно усиливая негативное воздействие (3).

Традиционно считается, что проблема микотоксикозов и зараженности кормов микотоксинами для крупного рогатого скота менее актуальна, чем для птицы и свиней. Однако было установлено, что некоторые микотоксины обладают ярко выраженными антимикробными свойствами, вызывая снижение численности полезных микроорганизмов, в том числе целлюлозолитиков, бацилл, лактатутилизирующих бактерий. Нарушения в составе микробиоценоза могут негативно влиять как на процессы пищеварения и усвояемость питательных веществ, так и на эффективность защитных функций полезной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте. Стоит отметить, что наибольшая восприимчивость к негативному воздействию микотоксинов проявляется у высокопродуктивных коров, поскольку рост продуктивности всегда сопровождается повышенной чувствительностью к стрессам. Помимо этого, микотоксины, поступающие в организм крупного рогатого скота с кормами, могут проникать в молоко, представляя опасность для здоровья человека. Так, остатки афлатоксина M i (метаболит афлатоксина В 1 ) в молоке составляют 0,3-6,0 % от потребленного афлатоксина В 1 (1).

В настоящее время практически отсутствуют сведения по накоплению микотоксинов в сочных кормах в процессе силосования, а также остается невыясненным вопрос о способах решения этой проблемы.

В задачу наших исследований входил анализ содержания микотоксинов на различных этапах силосования, а также исследование влияния биологических заквасок и химического препарата для консервирования кормов на снижение количества токсичных грибных метаболитов.

Методика . В модельном лабораторном эксперименте по консервированию использовали ежу сборную Dactylis glomerata L. первого укоса, убранную с поля в фазу выхода в трубку при влажности 65 %. При силосовании использовали штаммы бактерий, входящие в состав коммерческих заквасок биотроф и биотроф-111 (ООО «Биотроф + », г. Санкт-Петербург), а также препарат AIV 3 Plus («KEMIRA OYJ», Финляндия). Препарат био-троф-111 вносили в количестве 0,007 мл/кг зеленой массы (1 л на 150 т), AIV 2000 Plus — в количестве 4 мл/кг (4 л/т) зеленой массы. Зеленую массу (320 г) в вакуумных полиэтиленовых пакетах помещали в термостатную комнату при температуре 26±1 ° С. Образцы для анализа микотоксинов отбирали до силосования, а также на 3-и, 7-е, 14-е и 30-е сут хранения.

Количество микотоксинов (афлатоксинов, охратоксина А, Т-2 токсина, зеараленона, дезоксиниваленола) в образцах исходного кормового растительного сырья определяли с применением иммуноферментного ана- лиза (ИФА) (4), используя тест-систему AgraQuantTM («Romer Labs, Inc.», Австрия) согласно рекомендациям производителя. Микотоксины, за исключением дезоксиниваленола, экстрагировали из проб 70 % метанолом, дезоксиниваленол — дистиллированной водой. Стандартами служили растворы пяти анализируемых микотоксинов известной концентрации. В качестве остановочного раствора при анализе на наличие зеараленона и Т-2 токсина служила 10 % соляная кислота, афлатоксина, охратоксина А и де-зоксиниваленона — 10 % фосфорная кислота. Оптическую плотность (OD) измеряли при X = 450 нм на микростриповом фотометре Stat Fax 303+ («Awareness Technology, Inc.», США), сопоставляя показатели для образца и для стандартов. Поскольку в России в настоящее время ПДК микотоксинов для силоса не установлены, для сравнения использовали предельнодопустимые концентрации микотоксинов для фуражного зерна овса, пшеницы и ячменя как злаковых культур, по таксономической принадлежности близких к многолетним травам, к которым относится ежа сборная, исходя из значений, приведенных в Единых ветеринарных (ветеринарносанитарных) требованиях, предъявляемых к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору) (утверждены Решением Комиссии таможенного союза ЕврАзЭС от 18 июня 2010 года № 137): для афлатоксинов — 0,004 мг/кг, охратоксина А — 0,005 мг/кг, Т-2 токсина — 0,06 мг/кг, зеараленона — 0,1 мг/кг, дезоксиниваленола — 1,0 мг/кг (5).

Математическую и статистическую обработку результатов проводили стандартными методами дисперсионного анализа (6) с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010.

Результаты . Биотроф — закваска, которая представляет собой размноженную чистую культуру полезных бактерий, идентифицированных с помощью анализа первичной последовательности фрагмента 16S-рибосом-ной РНК как Lactobacillus plantarum (7). Биопрепарат предназначен для консервирования различных культур, в том числе подвяленных растений с низкой влажностью. Применение этой закваски обеспечивает быстрое подкисление консервируемой растительной массы за счет накопления молочной кислоты и подавление нежелательных микробиологических процессов (8). Биотроф-111 — закваска на основе размноженной чистой культуры бактерий, идентифицированных по первичной последовательности фрагмента р16S РНК как Bacillus subtilis . Биопрепарат рекомендован для консервирования любых культур, в том числе трудносилосуемых (бобовозлаковые смеси, козлятник восточный, клевер, люцерна и др.). При применении закваски биотроф-111 за счет высокой антагонистической активности бактерий в консервируемой массе ингибируется развитие гнилостной микрофлоры, плесневых грибов — продуцентов микотоксинов, дрожжей, что обеспечивает быстрое консервирование и созревание силоса (9). В состав химического консерванта AIV 2000 Plus входит смесь органических кислот (муравьиной, пропионовой, бензойной).

В кормовом растительном сырье, предназначенном для закладки на хранение, были обнаружены афлатоксины (0,0053±0,00025 мг/кг), зеарале-нон (0,0115±0,00048 мг/кг) и дезоксиниваленол (1,3±0,0062 мг/кг) (табл.). При этом количество афлатоксинов и дезоксиниваленола превышало значения предельно-допустимой концентрации для кормов растительного происхождения, принятые нами за референтные, в 1,3 раза. Следовательно, загрязнение микотоксинами кормовых культур происходит еще в период роста растений в результате развития фитопатогенных грибов. При этом содержание охратоксина А и Т-2 токсина было ниже предела достоверного определения методом ИФА.

Содержание микотоксинов (мг/кг сухого вещества) в силосе из ежи сборной Dactylis glomerata L. при применении биопрепаратов и консерванта ( M±m, лабораторный опыт)

Время си-

Контроль (K), мг/кг

Биопрепарат

Химический

лосования,

на основе лактобактерий

на основе бацилл

консервант

сут

мг/кг

|к К, %

мг/кг

|к К, %

мг/кг    к К, %

Афлатоксины (ПДК = 0,004 мг/кг)

0

0,0053±0,00025

0,0053±0,00025

0,0053±0,00025

0,0053±0,00025

3

0,0101±0,00040

0,0088±0,00040

87,1   0,0057±0,00026

56,4

0,0110±0,00040

108,9

7

0,0113±0,00047

0,0086±0,00042

76,1   0,0092±0,00043

81,4

0,0152±0,00065

134,5

14

0,0213±0,00800

0,0184±0,00070

86,4   0,0198±0,00080

93,0

0,0270±0,00094

126,8

30

0,0209±0,00100

0,0172±0,00060

82,3   0,0190±0,00047

90,9

0,0144±0,00071

68,9

0

3

< п.д.о.

0,0068±0,00023

Охратоксин А (ПДК = 0,005 мг/кг) < п.д.о.                      < п.д.о.

0,0053±0,00020    77,9   0,0060±0,00025

88,2

< п.д.о.

0,0089±0,00040

130,8

7

14

< п.д.о.

0,0127±0,00059

< п.д.о.

0,0059±0,00023

0,0003±0,00001

46,5   0,0031±0,00015

24,4

0,0009±0,00003

0,0739±0,00310

581,9

30

0,0295±0,00140

0,0232±0,00090

78,6   0,0192±0,00058

65,1

0,2720±0,01200

922,0

0

3

< п.д.о.

0,0937±0,02300

Т-2 т о к с < п.д.о. 0,0930±0,00410

и н (ПДК = 0,06 мг/кг) < п.д.о.

99,3   0,1025±0,00370

109,4

< п.д.о.

0,1089±0,00410

116,2

7

0,0391±0,01600

0,0396±0,00170

101,3   0,0140±0,00048

35,8

0,0336±0,00160

85,9

14

0,1221±0,00370

0,1118±0,00520

91,6   0,0965±0,00220

79,0

0,0834±0,00420

68,3

30

0,1116±0,00510

0,0892±0,00320

79,9   0,0750±0,00350

67,2

0,1191±0,00480

106,7

0

3

0,0115±0,00048 0,0213±0,00100

3 е а р а л е 0,0115±0,00048 0,0144±0,00036

нон (ПДК = 0,1 мг/кг)

0,0115±0,00048

67,6   0,0168±0,00065

78,9

0,0115±0,00048

0,0142±0,00061

66,7

7

0,0475±0,00170

0,0893±0,00410

188,0   0,0909±0,00380

191,4

0,1167±0,00350

245,7

14

0,1514±0,00360

0,1407±0,00670

92,9   0,1345±0,00630

88,8

0,0977±0,00320

64,5

30

0,1290±0,00610

0,1062±0,00051

82,3   0,1156±0,00460

89,6

0,0790±0,00290

61,2

0

3

1,3000±0,00620

0,6800±0,02800

Дезоксинив 1,3000±0,00620 0,4200±0,01800

а л е н о л (ПДК =1,0 мг/кг)

1,3000±0,00620

61,8   0,6900±0,03450 101,5

1,3000±0,00620

0,8100±0,02400

119,1

7

5,1200±0,22000

4,6600±0,20000

91,0   3,8100±0,12000

74,4

4,1200±0,19000

80,5

14

1,4000±0,04100

3,1900±0,12000

227,9   0,9900±0,03900

70,7

4,1700±0,20000

297,9

30

1,2900±0,05200

1,2800±0,03500

99,2   0,5700±0,02600

44,2

1,5000±0,06500

116,3

Примечание. < п.д.о. — ниже предела достоверного определения методом ИФА. Химический консервант AIV 3 Plus («KEMIRA OYJ», Финляндия).

При исследовании силоса из ежи сборной первого укоса на 3-и, 7-е, 14-е и 30-е сут хранения было обнаружено значительное накопление афлатоксинов, охратоксина А, Т-2 токсина, зеараленона и дезоксинивале-нола (см. табл.).

Динамика накопления зеараленона (1) , Т-2 токсина (2), охратоксина А (3), афлатоксинов (4) (А) и дезоксиниваленола (Б) в процессе силосования ежи сборной Dactylis glomerata L. без добавок биопрепаратов и химического консерванта (лабораторный опыт).

Представленные графики (рис., А) наглядно иллюстрируют, что в процессе силосования ежи сборной наблюдалось резкое возрастание содержания зеараленона и Т-2 токсина, незначительное увеличение показателя по афлатоксинам и охратоксину А (по сравнению с исходным растительным сырьем). При этом количество указанных микотоксинов (кроме охратоксина А) уменьшалось во второй половине срока хранения. Содер-126

жание дезоксиниваленола на 3-и сут резко возрастало (см. рис., Б), а на 7-е сут стремительно падало.

Отметим, что продуцентами зеараленона, Т-2-токсина и дезоксиниваленола служат грибы рода Fusarium , которые начинают вырабатывать микотоксины в течение вегетации растений, и образование микотоксинов может продолжаться в период хранения кормов (10). Известно, что в результате резкого изменения условий окружающей среды (температура, влажность, воздействие химических веществ) продукция микотоксинов усиливается (11-15). В нашем эксперименте воздействие условий окружающей среды в процессе силосования могло, возможно, послужить стрессовым фактором, спровоцировавшим активный синтез зеараленона и Т-2 токсина микроскопическими грибами вплоть до 14-х сут хранения силоса . После 14-х сут, вероятно, произошла остановка развития и гибель грибов с последующим микробиологическим разложением токсичных продуктов их метаболизма. Грибы — продуценты дезоксиниваленола, вероятно, в силосе практически не развиваются. После 3-х сут хранения дезоксиниваленол, скорее всего, подвергался деструкции под воздействием микроорганизмов.

Продуцентами афлатоксина и охратоксина А служат грибы родов Aspergillus и Penicillium , для развития которых условия силосования благоприятны (10). Вследствие этого указанные микроорганизмы не испытывали необходимости в инициации механизмов защиты (продуцирование значительного количества микотоксинов), поэтому скорость накопления афлатоксина и охратоксина А в течение нашего эксперимента была невелика.

Величина, соответствующая ПДК и принятая нами за референтную, по афлатоксинам оказалась превышена в 1,4-6,8 раза, по охратоксину А — в 1,2-54,4 раза, Т-2 токсину — в 1,4-1,8 раза, зеараленону — в 1,2-1,5 раза, дезоксиниваленолу — в 1,3-5,1 раза (см. табл.). В связи с этим консервирующие препараты, используемые для силосования, должны не только обеспечивать получение качественного корма, сбалансированного по содержанию белка, энергетической питательности, биологической ценности, но и обладать мощной антифунгальной активностью, сдерживая накопление микотоксинов, продуцируемых грибами. Известно, что потенциальной способностью к подавлению развития микроскопических грибов, а также к деструкции токсичных продуктов их метаболизма обладают некоторые штаммы молочнокислых бактерий и бацилл (16).

Действительно, применение биологических заквасок на основе молочнокислых бактерий (биотроф) и бацилл (биотроф-111) позволило уменьшить содержание афлатоксинов соответственно на 12,9-23,9 и 7,043,6 % в течение всего периода силосования по сравнению с контролем. В конце срока хранения силоса количество афлатоксинов в вариантах с применением этих заквасок было соответственно на 17,7 и 9,1 % ниже по сравнению с контрольным вариантом. В варианте с применением химического консерванта на 3-и, 7-е и 14-е сут хранения количество афлатоксинов было на 8,9, 34,5 и 26,8 % выше контрольного, а на 30-е сут хранения оно снизилось на 31,1 % по сравнению с контролем.

Использование заквасок на основе молочнокислых бактерий и бацилл приводило к значительному снижению содержания охратоксина А на протяжении всего периода силосования по сравнению с контролем. Исключение составляют 7-е сут, когда этот токсин был обнаружен в варианте с применением биопрепарата биотроф-111 (0,0003±0,000007 мг/кг), тогда как в контроле содержание охратоксина А было ниже предела достоверного определения методом ИФА. В конце срока хранения силоса количество охратоксина А в вариантах с применением заквасок биотроф и биотроф-111 оказалось соответственно на 21,4 и 34,9 % ниже, чем в контроле. При использовании химического консерванта на протяжении всего периода силосования содержание охратоксина А было значительно выше контрольного. В конце опыта количество охратоксина А на 822 % превысило соответствующий показатель в контроле.

Применение закваски биотроф-111 (на основе бацилл) и химического консерванта на 3-и сут хранения приводило к некоторому увеличению содержания Т-2 токсина относительно контроля. Начиная с 7-х сут вплоть до конца срока хранения, происходило значительное снижение количества названного токсина (за исключением 30-х сут в варианте с использованием химического консерванта, когда содержание Т-2 токсина было выше контроля на 6,7 %). При использовании препарата биотроф на основе молочнокислых бактерий с середины срока и вплоть до окончания опыта этот показатель уменьшался.

В присутствии заквасок биотроф, биотроф-111 и химического консерванта на протяжении всего силосования также значительно снижалось количество зеараленона. Исключение составили 7-е сут, когда содержание этого токсина во всех опытных вариантах было выше, чем в контроле.

Закваски на основе бацилл снижали содержание дезоксиниваленола на 25,6-55,8 % с 7-х по 30-е сут хранения силоса. Использование закваски на основе молочнокислых бактерий приводило к уменьшению количества дезоксиниваленола на 3-и и 7-е сут. В конце срока хранения содержание дезоксиниваленола в варианте с применением биотрофа практически не отличалось от контроля. В то же время при применении химического консерванта количество дезоксиниваленола на 3-и, 14-е и 30-е сут значительно (на 16,3-197,9 %) возрастало.

Известно, что токсичные метаболиты грибов в кормах действуют как синергисты, дополняя и усиливая токсические эффекты друг друга (17-20). Поскольку в исследованном нами силосе из ежи сборной микотоксины присутствовали в сочетании, то для уточнения и сравнения характера воздействия изученных препаратов мы условно определили токсичность силоса как сумму превышений по афлатоксинам, охратоксину А, Т-2 токсину, зеараленону и дезоксиниваленолу относительно значений, принятых в этой работе в качестве референтных.

В течение всего силосования такая суммарная токсичность образцов в вариантах с использованием биопрепаратов биотроф (на основе лактобактерий) и биотроф-111 (на основе бацилл) была ниже, чем в контроле. Наименьшую суммарную токсичность силоса отмечали в варианте с закваской биотроф-111. При этом соответствующий показатель в случае химического консерванта оказался наибольшим, значительно превысив во второй половине периода хранения контрольные значения. Как отмечалось выше, в результате резкого изменения условий окружающей среды (температуры, влажности, воздействия химических веществ) продукция микотоксинов у микроскопических грибов усиливается (21, 22). В связи с этим в нашем эксперименте воздействие химического консерванта могло послужить стрессовым фактором, спровоцировавшим активный синтез микотоксинов.

Таким образом, впервые в России изучена динамика накопления микотоксинов в силосе на разных этапах хранения. Нами показано, что еще в течение вегетации растений полевые изоляты грибов начинают вырабатывать микотоксины, и этот процесс активно продолжается в период хранения силоса. Применение заквасок на основе молочнокислых бакте-128

рий Lactobacillus plantarum (биотроф) и бацилл Bacillus subtilis (биотроф-111) позволило сдержать накопление микотоксинов по сравнению с контролем (без добавок). Наибольшим эффектом обладала закваска на основе Bacillus subtilis (биотроф-111). Использование химического консерванта приводило к частичному снижению содержания некоторых микотоксинов по сравнению с контролем, однако суммарная токсичность силоса была высокой и во второй половине срока хранения оказалась значительно выше контрольных показателей. Известно, что в результате резкого изменения условий окружающей среды продукция микотоксинов у микроскопических грибов усиливается. В нашем эксперименте воздействие химического консерванта могло послужить стрессовым фактором, спровоцировавшим активный синтез микотоксинов. Следовательно, очень актуальным представляется создание биопрепарата на основе бацилл, необходимого для уничтожения микроскопических грибов и разложения микотоксинов в силосе, поскольку применение химических консервантов не обеспечивает решения этой проблемы.

ООО «Биотроф+»,                                 Поступила в редакцию

196602 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,                         8 се^тября 2014 года

DYNAMICS OF MYCOTOXIN ACCUMULATION IN SILAGE DURING

STORAGE

G.Yu. Laptev, N.I. Novikova, L.A. Il’ina, E.A. Yyldyrym, V.V. Soldatova,

I.N. Nikonov, V.A. Filippova, E.A. Brazhnik, O.N. Sokolova

Статья научная